本科生毕业论文（设计）
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指导教师: 氯化锶对甜叶菊离体增殖及体内POD、 SOD及CAT活性表达的影响 周 勇 农 学 院 农 学 农学112 118110228
胡能兵 职称: 副教授
2015年 5 月 15日 安徽科技学院教务处制
目 录
摘要 ............................................................................................................................... 1 关键词 ........................................................................................................................... 1 引言 ............................................................................................................................... 1 1 材料与方法 ............................................................................................................... 1 1.1 材料 ......................................................................................................................... 1 1.2 技术路线 ................................................................................................................. 2 1.3 方法 ........................................................................................................................ 2 2 结果与分析 ................................................................................................................ 3 2.1 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊发芽数目的测定 ................................................ 3 2.2 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊SOD活性表达影响的测定 .............................. 4 2.3 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊POD活性表达影响的测定 ............................. 5 2.4 不同氯化锶浓度处理对甜叶CAT活性表达影响的测定 ................................ 5 3 结论与讨论 ................................................................................................................ 5 致谢 ............................................................................................................................... 6 参考文献 ....................................................................................................................... 7 英文摘要 ....................................................................................................................... 8
氯化锶对甜叶菊离体增殖及体内POD、SOD
和CAT活性表达的影响
11级农学专业：周勇 指导老师：胡能兵
摘要：以甜叶菊组培苗为外植体，研究不同浓度氯化锶对甜叶菊离体增殖及体内POD、SOD和CAT活性表达的影响。试验结果表明，氯化锶浓度的变化对甜叶菊对甜叶菊的增殖及酶活性有一定的影响，在1.5mol/L的氯化锶浓度下，甜叶菊的离体增值率最高为；叶片中SOD、POD及CAT酶活性表达有促进作用。活性最强
关键词：甜叶菊 氯化锶 酶活性影响
引言 甜叶菊又名甜菊、甜草，原产于南美洲巴拉圭、巴西的原始森林，是菊科多年
生草本植物，被称为“活糖精”[1]，在亚温带地区，栽种一次可活多年。甜叶菊有一定的药理作用，有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，亦有治疗糖尿病，肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效[2],甜叶菊不但夺得了“甜味世界”的冠军，还被称作“时髦的甜味品”。
甜叶菊作为一种新型的甜味剂，然而在当前，在甜叶菊种子问题方面却有着种质资源的保存不佳、生活力不高等一系列弊端，因此，采用扦插、无性繁殖等快速繁殖方式对于甜叶菊的种质资源的保存有着重要的意义[3-5]。目前对于甜叶菊的发展研究主要放在栽培、组培快速繁殖、糖苷鉴定于品种选育等方面，主要将激素种类、培养及类型及浓度配比作为主要的研究方向，然而稀土元素对于甜叶菊的离体增殖的影响及有关酶的活性表达的报道却实属少见。锶元素作为稀土元素之一 ,对生命活动具有重要的调节作用，是不可获缺的微量元素 。
本试验研究不同氯化锶浓度对于甜叶菊离体增殖和酶活性表达的影响，以期筛选出最适宜甜叶菊增殖的最适浓度，为甜叶菊的组织快繁和生产用苗奠定基础，为甜叶菊的种质资源的保存持续利用和优化甜叶菊繁殖技术提供新的思路，以便更好地提升甜叶菊发展的新市场[9]。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 试验材料
甜叶菊外植体为“皖甜1号-18”组织培养试管苗。 1.1.2 主要药品
Na2HPO4、NaH2PO4、甲硫氨酸、氮蓝四唑、DTA—Na2、核黄素、植物生长调节剂6 苄基腺嘌呤( 6 － BA)、萘乙酸（NAA）等药品购于上海稼丰园艺用品有限公司。
1.2 方法
1.3.1 无菌苗的获取 从田间选取生长健壮、无病虫害的植株茎段，加入少量洗衣粉在自来水下冲洗10 min后，放入超净工作台中，用75%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞溶液消毒8min，最后用无菌水冲洗4次，接种到1/2 MS的培养基上。20d后，将其萌发的腋芽转接到MS培养基上进行增殖扩繁。
1.2.1 培养基配制
甜叶菊增殖培养基：MS+0.1 mg•L-1 NAA +1.0 mg•L-1 6-BA+30 g•L-1蔗糖+5.0 g•L-1琼脂粉。氯化锶设定为8个浓度，分别为0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、15mol/L、25mol/L。向培养基分别加入不同浓度的氯化锶。灭菌前用1.0 mol/L的NAOH溶液调节pH为6.0，分装后于高压灭菌锅中121℃灭菌，灭菌时间为20min。 1.2.2接种
选取生长状况良好的甜叶菊组培苗，在净化工作台上将甜叶菊的芽尖剪下并接种到各处理的培养基中。每瓶接种4个芽尖数，接种位置尽可能保持一致。每处理3个重复，每个重复4瓶，共12瓶。接种后放在23±2℃，2000lx光照12h/d的条件下进行培养。接种后的第30天统计，统计增殖苗总数、株高，计算出增殖率、再生苗平均株高。
每瓶接4个茎段，每重复接4瓶， 3次重复。培养温度为25±2℃，2000lx光照12h/d的条件下培养。
增殖率=增殖苗总数/接种苗总数×100%，再生苗平均株高=再生苗株高总和/再生苗总数。
1.2.3试验数据统计、分析
接种1个月后统计各处理苗的茎段增殖率（茎段增殖率=增殖腋芽数/接种茎段数），数据采用DPS与Excel进行分析处理。 1.2.4酶液提取
各处理称取0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液，冰浴研磨，研磨后再加1ml缓冲液，倒入离心管中，再用2ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，在4℃离心20min，离心后倒出上清液放置于冰箱中保存[6-8]。 1.3 酶液的提取
称0.5g甜叶菊茎叶，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L，PH＝7.8），冰浴研磨，研磨后再加1ml缓冲液，倒入离心管中，再用2ml缓冲液清洗研钵，并倒入离心管中，低温（0～4℃）离心20min（10500rpm），离心后冷藏保存。 1.2.5 SOD的活性测定
取型号相同的试管，试管中加50μL上清液,2支对照试管中各加煮死酶液50μL，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应20～30 min。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560nm下比色测定吸光度值，做好相应的数据记录与统计工作[10-11]。 1.2.6 甜叶菊叶片POD的活性测定
采取愈创木酚法，分别于各处理取上清液20μL加入比色杯中（对照加20μL磷缓），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值），并做好数据记录与统计工作。 1.2.7 甜叶菊叶片CAT的活性测定
取上清液100μL加入比色杯中（对照加100μL磷缓），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值），做好数据记录与统计工作。
2 结果与分析
2.1 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊发芽数目的测定 表1 不同处理对甜叶菊离体增殖的影响
处理编号1 2 3 4
氯化锶(mol/L)0 0.2 0.4 0.6
接种茎段数48 48 48 48
芽数增殖率0.75bc 0.69bc 0.88b 0.75bc
5 6 7 8 9
0.8 1.0 1.5 15 25
48 48 48 48 48
1.02b 1.88a 2.30a 0.75bc 0.26c
注：表中不同小写字母表示5%显著水平
由表1可知，一定范围内较高浓度的氯化锶处理对甜叶菊的增殖有一定的促进作用，过高浓度的氯化锶对于甜叶菊的增殖有抑制作用。处理S6、S7与对照组S1有显著差异，其它处理与对照组没有显著差异。其中，处理S6与处理S7的增值率高于对照组，由图2可以看出，处理S5-S7这一浓度范围内，甜叶菊增值率呈现稳定上升的趋势，其中在处理7的甜叶菊增值率达到最高为2.30，处理8-9呈现下降的趋势，其中处理9 的增值率达到最低为0.26。
2.2 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊酶活性的影响
图2 不同浓度氯化锶处理对甜叶菊SOD活性表达影响测定
由图2可知，不同浓度的氯化锶处理对于甜叶菊SOD的活性表达有不同程度的
影响，与对照组S1相比，仅处理S7的活性值对照组，活性值为12.17，在处理S1-S3呈现下降趋势，在处理S4-S7这一浓度范围内的活性值呈现上升趋势，处理S8与S9相比较于其它处理有着明显的差距，在处理7即当氯化锶的浓度达到1.5mol/L时，SOD的活性值达到最高为12.17，在处理9即氯化锶的浓度为25mol/L时，SOD的活性值达到最低为0.15。
2.3 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊POD活性表达影响的测定
图3 不同浓度氯化锶处理对甜叶菊POD活性表达影响测定
由图3可知，相比于对照组S1，在处理S2-S9的POD活性值基本呈上升趋势，
处理S7-S9呈下降趋势，其中，在处理S8即氯化锶浓度为15mol/L时，甜叶菊POD 的活性值达到最低为9.11，而当氯化锶浓度为0.8mol/L即处理S5时，甜叶菊中的POD的活性值达到最高值为14.57。
2.4 不同氯化锶浓度处理对甜叶菊CAT的活性表达影响的测定
图4 不同浓度氯化锶处理对甜叶菊CAT活性表达影响测定
由图4可知，相比较于对照组S1，处理S3-S6的CAT活性值基本趋于稳定，其中，在处理S2即氯化锶浓度为0.2mol/L时，甜叶菊CAT 的活性值达到最低9.27，而当氯化锶浓度为15mol/L即处理8时，甜叶菊中的CAT的活性值达到最高值18.26。
3 结论与讨论
本试验筛选出最适合的氯化锶浓度为1.5mol/L；在此浓度下，氯化锶芽数增值
率达到最高值；不同氯化锶浓度处理对甜叶菊体内的SOD、POD及CAT有不同的促进程度，较低和较高浓度均抑制SOD、POD酶的活性表达，低浓度下抑制CAT酶的活性表达。
从本试验可以看出采用一定较高浓度的氯化锶溶液对甜叶菊进行处理， 在一定程度上，可促进甜叶菊幼苗芽数增值率的提高、SOD、POD、CAT酶的活性表达，从而促进了甜叶菊幼苗的生长。而在低浓度下对于酶的活性表达促进程度不明显，当浓度增加到25mol/L时，甜叶菊试管苗的生长受到了抑制，SOD、POD酶的活性表达变弱。由此，高浓度的氯化锶改变了叶片中酶的活性表达能力，这可能是抑制了甜叶菊的生长、芽数增值率的提高甚至导致其死亡的原因，陈刚名等[13]用不同浓度氯化锶浸种对西瓜生长的影响， 400mg/L 的氯化锶溶液浸种处理的为最好，说明氯化锶对于作物生长确实有促进作用。本试验与前人试验的结果相符。而试验得出促进植物生长的最适宜浓度不同，这可能是由于所使用的处理对象种类不同造成的。本试验依据锶在我国的农业生产上的应用现状， 试验结果为甜叶菊的增殖快繁、生产用苗提供基础参考材料和新的思路。
致谢
非常感谢何克勤老师对于实验过程中的悉心指导，指出实验过程中的种种问题，
并耐心的讲解让我得以改正实验中的不足之处，并加以改正。
参考文献：
[1] 王元海.栽培技术要点[J].上海农业科技,2009.6:99-100. [2] 马磊,石岩.甜叶菊的综合开发利用[J]. 中国糖料,2009,4:79-81. [3] 张莉莉.甜味剂工业现状与发展[J].化工中间体2012,10: 7 － 11．
[4] Ibrahim I A，Nasr M I，Mohammedm B R，et al． Plant growth regulators affecting in vutro cultivation of Stevia rebaudiana[J]．Sugar Tech，2008，10( 3) : 254 － 259．
[ 5] 彭志红, 彭克勤 , 胡家金 , 等 .渗透胁迫下植物脯氨酸积累的研究进展 [ J ] .中国农学通报, 2002, 18( 4) : 80 -83.
[ 6] 汪贵斌 , 曹福亮 , 张往祥 .银杏品种耐盐能力的研究 [ J ] .林业科学, 2003, 39( 5) : 168 -172 [7]吴贵容.植物组织培养的应用及存在问题[J]高教论坛，2012，18( 23):84-86.
[8] 崔广荣,何克勤,张子学,胡能兵,王其斌.甜叶菊的组织培养[J].安徽科技学院学报，2011，25( 5) : 23 ～ 28.
[9] 陆晓民,盛伟,杨安徽科技吉.模拟酸雨下氯化镧处理对小麦发芽及幼苗生长的影响[J].核农学报,2008,30(1):86-89.
[10] 杨军,张赫,王甲辰,等.稀土抑菌作用研究[J].稀土,2009,30(1):35-39.
[11] 宋艳.环境激素莠去津对蚕豆、斑马鱼、蚯蚓的dna损伤及相关酶的影响.[J]山东农业大
学,2012,5(6):77-81
[12] 陈庆榆,陆晓民,张远兵,等.叶面喷施不同浓度的氯化镧对毛豆幼苗生长的影响[J]1中国林副特产,
2006, 6:8-91.
[13]王 振, 陈刚明 ,周建业.不同浓度氯化锶浸种对西瓜生长的影响[J]安徽农学通报，Anhui Agri. Sci.
Bull. 2012，18( 23):84-86.
Effect of strontium chloride on the proliferation of the leaves of
the sweet chrysanthemum and its expression of POD, SOD and CAT in leaves
Student majoring in agriculture:Zhou Yong
Supervisor: Hu Neng Bing
Abstract:Stevia somaclone as explant, the research of different concentration of strontium
chloride stevia proliferation in vitro and in vivo effect of POD, SOD and CAT activity
expression. The test results show that the strontium chloride concentration changes of stevia
has certain influence to the proliferation of stevia, under the strontium chloride concentration
of 1.5 mol/L, stevia in vitro is highest, hence blade of SOD, POD and CAT enzyme activity
stimulates expression.
8
Key words: Stevia Strontium chloride Enzyme activity influence
9