酶工程复习资料
名词解释
酶(enzyme)：酶是由活细胞产生的，在细胞内、外一定条件下都能起催化作用的具有高效率和高度专一性的一类特殊蛋白质。
酶工程(enzyme engineering)：酶工程是酶学与工程学相互渗透、结合并发展而形成的一门新的技术科学，是一门从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应的原料转化为有用物质的技术。
固定化酶(immobilized enzyme)：通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上。
酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。
酶活力单位：表示酶活力大小的尺度；
一个国际单位（IU）是指在特定条件下（25 0
C），每分钟内转化1μmol底物或催化形成1μmol产物所需的酶量 一个Kat(卡塔尔，酶活性国际单位)是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量，1 Kat = 6⨯107
IU。
酶的比活力：酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。比活力=酶活力单位数（U）酶蛋白质量（
mg）
调节基因：
启动基因：
操纵基因：
结构基因：
酶的抽提：指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分融入溶剂的过程。
膜分离技术：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。
凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离。
凝胶电泳——以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。
酶的结晶：是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，是酶和蛋白质等生物大分子分离纯化的方法之一
酶的回收率和提纯倍数:
纯化倍数是纯化后的比活除以纯化前的比活。
酶的发酵生产：通过微生物（或动植物细胞）的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程。
固定化细胞发酵：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞
发酵动力学：是研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。包括细胞生长动力学、反应基质消耗动力学和酶生成动力学等，通过这些研究了解酶的生物合成模式，对发酵条件的优化控制,提高酶产量具有重要的理论指导意义。
酶分子修饰：通过各种方法可使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。
通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术，称为酶分子的化学修饰。
2、什么是酶的专一性？
酶对它所作用的底物有严格的选择性，一种酶只能作用于一类化合物或特定的化学键，这种现象称为酶的专一性。其专一性分为结构专一性和立体异构专一性，其中，结构专一性包括只作用于一种底物的称为绝对专一性和一种酶可作用于一类化合物或一种化学键的称为相对专一性。
3、简述酶活力测定的步骤。 酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。①选择底物，配制底物溶液②确定酶促反应条件：PH、温度等③准确计时并终止反应④运用各种检测技术，快速、简便、准确的测量变化量
5、简述固定化酶的活力测定方法有哪些？
固定化酶的活力测定方法可用终止反应法或连续反应法。其中终止法包括：化学法、放射性化学法、酶偶联法；连续反应法包括：光谱吸收法（分光光度法和荧光法）、量气法、量热法、偶联的连续法。
6、酶的生产方法有哪些？
①酶的天然产物提取②酶的发酵生产
7、酶工程的研究内容有哪些？
按照现在的观点，酶工程主要研究的内容有：1、酶的大批量生产、应用2、酶的分离纯化3、酶的固定化和固定化酶反应器4、新酶的开发和应用5、遗传修饰酶的研究6、酶生产中基因工程7、抗体酶、核酸酶的研究8、酶分（1）盐析法的原理：根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高二增加，表现为“盐溶”，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为“盐析”的这一特性，由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。
（2）等电点沉淀法原理：两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质是不同等电点，由此可将酶子改造与修饰9、酶的结构与功能关系10、模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计等。
8、酶分离纯化的基本环节有哪些？
样品组织→预处理（破碎、抽提、离心分离）→无细胞抽
提液→粗分离（提取、盐析、沉淀）−−过滤（超滤、分子滤）
−−−−
−→细分离（层析）→成品加工、浓缩干燥
9、酶液制备的过程有哪些？
酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽提液的浓缩等几个步骤
10、细胞破碎的方法有哪些？ 细胞破碎：物理和化学两大类方法
1、 物理破碎：研磨（手磨，球磨和石磨），机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），高压法，爆破性减压法，
专用波振荡，快速冷冻融化法等。
2、 化学破碎：渗透作用，自溶，酶处理，表面活性剂
11、说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。 优点：①乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品跟纯净（不需要脱盐处理）；②有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。
缺点：①容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限。②采用大量有机溶剂，成本较高。③有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应由防护措施。
12、酶的结晶方法有哪些？
酶的结晶方法有：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、等电点结晶法、透析平衡结晶法、微量蒸发扩散法、其他方法放如：气相扩散法、温度诱导法、复合结晶法等。 13、分析说明酶分离纯化的应用方法（概念、原理和过程）。 现有的纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质。稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立，主要有如下几类：
根据溶解度建立的方法：盐析法，有机溶剂沉淀法，
共沉淀法及选择性沉淀法，等电点沉淀法等。 根据分离颗粒大小、重量差别建立的方法：离心法、凝胶过滤法、超过滤法。
纯化。
（3）有机溶剂沉淀法原理：利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法为有机溶剂沉淀法
（4）复合沉淀法原理：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法将酶从复合物中重新析出，此即为复合物沉淀法。
14、酶发酵生产的方式有哪些？（根据细胞培养方式的不同）
根据细胞培养方式的不同酶发酵生产的方式有：微生物发酵、动物细胞培养生产酶、植物细胞培养生产酶 根据微生物的培养方式可分为：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵
15、酶发酵生产常用的微生物有哪些？简介产酶性质。 1）、枯草芽孢杆菌2）、大肠杆菌3）、黑曲霉4）、米曲霉5）、青霉6）、木霉7）、根霉8）、毛霉9）、链霉菌10）、啤酒酵母11）、假丝酵母特点：1.酶的产量高2.用以培养和管理)3。产酶稳定性好4。利于酶的分离纯化5。安全可靠，无毒性
16、简述发酵工艺条件是如何调节控制的。
①pH值的影响及控制 —— 酶生产的合适pH 通常和酶反应的最适pH值相接近。生成碱性蛋白酶的芽孢杆菌宜在碱性环境下培养；生产酸性蛋白酶的青霉和根霉应在酸性环境下培养。
②温度控制 —— 为了有利于菌体生长和酶的合成，可进行变温生产。例如枯草杆菌AS1.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度从31oC逐渐升温至40oC，然后再降温至31oC进行培养，产量提高66%。重组E. coli一般先37ْC培养，加诱导剂后28ْC产酶。
③通气搅拌的影响 —— 酶生产所用的菌种一般都是需氧微生物，培养时都需要通气搅拌。一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利。因此必须根据不同的需要控制不同时期的通气量。
④生长期与产酶的关系 —— 微生物生长期与产酶有一定的关系，因菌种而异常。如曲霉的蛋白酶当菌体生长进入对数生长期时大量分泌；芽孢杆菌的碱性蛋白酶在对数生长期末大量形成芽孢时才生成。
17、提高酶产量的措施有哪些？
1) 添加诱导物 2) 降低阻遏物浓度3)添加表面活性剂4)添加产酶促进剂
18、举例说明酶合成的诱导现象、阻遏现象
酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（a）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（b）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（c）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。 酶合成阻遏的现象：
实验： （a）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （b）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。
（c）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
19、酶生物合成的模式有哪些？ 酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：1、同步合成型：又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。2、延续合成型：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。3、中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。4、滞后合成型：只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累。
20、简述固定化细胞发酵产酶的特点及其工艺条件的控制。
特点：易于将酶与底物及产物分离，产物相对容易提纯；酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；大多数情况下可以提高酶的稳定性；可以增加产物的收率，提高产物质量；有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。
工艺条件的控制：1、固定化细胞的与培养：采用生长培养基和适合细胞生长的工艺条件；2、溶解氧的供给：加大通气量；3、温度的控制：培养基进入反应器之前，必须预先调节至适宜的温度；4、培养基组分的控制：注意培养基组分对固定化载体的影响。
21、简述植物细胞发酵技术及其产酶工艺条件的控制。 植物细胞发酵技术首先从植物组织仲选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA从组等技术而获得高产、稳定的植物细胞。然后，用植物细胞在人工控制条件的植物细胞反应器中，进行发酵获得各种所需的产物。
植物细胞发酵产酶的工艺条件控制：（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基：大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源（蔗糖）,如MS培养基和B5培养基；（2）温度和pH值；（3）通风与搅拌；（4）前提的添加；（5）刺激剂的应用。
22、影响酶反应器操作的因素有哪些？如何确定及控制这些因素？
影响酶反应器操作的因素有：（一）反应温度的确定与调节控制 （二）pH值的确定与调控 （三）底物浓度 （四）酶浓度（五）搅拌速度（六）流动速度 （七）微生物污染
23、酶分子的化学修饰方法有哪些？
酶分子的化学修饰方法主要有：①酶的表面修饰；②酶分子的内部修饰③与辅因子相关的修饰④金属酶的金属取代
24、什么是抗体酶？抗体酶的制备方法有哪些？ 一种具有催化活性的蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水平上交叉渗透研究的产物；其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶的属性，因此抗体酶又称为催化抗体（Catalytic Antibody)。
抗体酶的制备方法有：1 稳定过渡态法、2、抗体与半抗原互补法3 拷贝法4 诱导法：5 引入法化6、化学修饰
25、什么是模拟酶？模拟酶有哪些类型？ 用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。迄今为止，已经有了多种类型的模拟酶：①小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环番、环芳烃和卟啉等大环化合物等。②大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶束酶模型等。③利用化学修饰、基因突变等手段改造天然酶产生了具有新的催化活性的半合成人工酶。
26、简述一下分子印迹的原理。
分子印迹实际上是指制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。通常将这一化合物称为印迹分子或者模板分子。分子印迹技术包括如下内容：①选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；②在印迹分子—单体复合物周围发生聚合反应；③用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。通过这样处理，形成的聚合物内保留有与印迹分子的形状﹑大小完全一样的空穴，也就是说印迹的聚合物能维持相对于模板分子的互补性，因此，该聚合物就能以高选择性重新结合模板分子。
酶的特点：高效催化性、高度专一性、活性的可调节性、活性的不稳定性
影响酶的催化作用的因素：底物浓度、产物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂浓度、抑制剂浓度
影响酶提取的主要因素：温度、PH、搅拌、污染、提取液的体积
酶活力测定可用终止反应法或连续反应法
分离纯化的注意事项：①防止酶的变性失活：a、低温进行保持酶活；b、保持一定的PH值，过酸过碱都会使酶失活；c、提取分离沉淀时要接近等电点的PH值；②操作迅速进行；③前后两种方法的相容性④不适宜连续重复使用酶，应以同一种性质的分离方法。
最理想的酶合成模式是延续合成型。
酶的固定化方法：吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、无载体的固定化以及多种固定化途径的联用等
11、（一）酶为什么要分离纯化
①、抑制或利用酶需要知道酶的性质，而研究酶需要一定纯度的酶；
②、研究酶的结构、底物特异性或动力学参数需要纯酶； ③、酶应用时尤其是用于药物时，需要高纯酶，否则易引起过敏等不良反应。
（二）、酶的分离纯化方法如下：
（三）分离纯化时注意事项。
①低温进行，保持酶活；
②保持一定的pH值。过酸过碱都易引起酶失活，提取时应远离pI，沉淀分离时接近pI；
③过程应尽可能快速进行；
④设法抑制酶活，以防酶之间的相互作用； ⑤注意前后两个方法的相容性。透析、凝胶、过滤使样品变稀，紧接着应采用浓缩效果较好的分离方法；
⑥在酶的分离纯化过程中，不宜连续重复使用以酶的同一性质为依据的分离方法。如在离子交换色谱后，不应采用以电荷性质为依据的分离方法。
（四）酶的一般纯化步骤。 ———— 生物体组织
预处理 ↓（破碎、抽提、离心分离） ———— 无细胞抽提液
↑ ↓除核酸（以防干扰pro分离，等电点法）
粗分离 盐析法（（NH4）2）SO4分级沉淀法）或等电点沉淀
↓ ↓
———— 分子筛法（透析、超滤、凝胶过滤） ↑ ↓
细分离 离子交换层析或亲和层析 ↓ ↓
———— 透析→较纯酶液→电泳法检验纯度 12、列举酶在淀粉类食品、蛋白类食品及果蔬类食品方面的应用？简述酶的应用对食品科学的发展意义？
答：目前酶在食品中的应用领域主要有： （一）酶的食品应用：
a、淀粉类食品：1）、α淀粉E及葡萄淀粉酶，用于生产葡萄糖；2）、用葡萄糖异构酶生产果葡糖浆；3）、用α淀粉酶、β淀粉酶生产多糖。
b、蛋白质类食品：1）、凝乳酶用于干酪生产；2）、乳糖酶水解乳糖；3）、用葡萄糖氧化酶，除去蛋粉等制品中存在的少量葡萄糖以防止褐变，提高产品质量；4）、醉酒抗寒，肉类嫩化。
c、果蔬加工方面：1）、果胶酶用于果汁、果酒澄清，提高可过滤性，增加出汁率；2）、柚苷酶可用于分解柑桔类果肉和果汁中柚皮苷，除苦味；3）、橙皮苷酶可使橙皮苷分解，有效防止柑桔类罐头制品出现白色浑浊。 （二）酶对食品工业及食品科学的发展具有重大意义，主要体现在：
①酶是高效的生物催化剂，其高度专一性，高效的催化效率以及温和的反应特性，决定了酶生产过程产品质量高，耗能低，废物排放少，应用于食品工业，可充分利用有限的农产品资源，具有非常重要的现实意义。
②酶产业是一种高效的产业。酶作为高效的生物催
化剂应用于食品工业时，可以获得很高的附加值。如美国1985年用葡萄糖异构酶生产高果糖浆，其附加值达30多倍（24亿/6000万）。
③生物界酶的种类达2000多，合理开发和使用，可广泛应用食品等工业过程。目前已开发并获得应用的只有几十种，因此酶制剂及其应用工业具有非常广阔的前景。的产物阻遏。因此用于黑曲霉酸性proE生产的培养基应限制氨基酸等成分的含量，同时在生产过程中，为防止产物阻遏，可采用中途补料等方法。
③抑制分解代谢物的阻遏。一些容易利用的碳源如葡萄糖往往容易阻遏果酶的生物合成。其阻遏的机理是代谢物通过代谢途径降解，一部分能量贮于ATP中。因此培已获应用的酶已初步证明这一点。
④从酶的应用，不难分析得到酶至少在以下几方面对食品科学产生的重要影响：a 、改造食品原料（包括植、动，及微生物可食部分）。例如通过改造酵母的基因，获得重组凝乳酶的表达。国外已经商品化 用于奶酪生产，再如通过适当手段控制材料中的酶活性，使原料易于保鲜及保存；
b、促进食品加工工艺改良，如双酶法生产葡萄糖，取代了传统的酸解法；
c、改造食品分析手段，如脲酶电极用于各项目的分析，还有用固定化的葡萄糖氧化酶测定葡萄糖含量等。
13、酶生物合成方面的因素有哪些？具体到酸性蛋白酶的生产，分析提高产酶量可能的措施？ 酶生物合成调节方面的因素
普遍地讲，通过生物合成调节酶产量的措施有： （1）、添加诱导物。①酶的作用底物。②酶的反应产物。③酶的底物类似物。
（2）、抑制阻遏物浓度。①产物阻遏作用。②分解代谢物阻遏作用。
（3）、添加表面活性剂。 （4）、添加产酶促进剂。
相应地，具体到黑曲霉酸性蛋白酶的生产，可采取以下措施提高产酶量。
①添加诱导物。其作用的本质是纯化R产生的变构pro，使其不能与操纵结合。酶一般都可由其作用底物诱导产生。蛋白质等类似物可用黑曲霉酸性蛋白酶生产的诱导物，在培养基中采用低的碳氮比有益于酶的生产。
②抑制产物的阻遏作用。许多酶可能由其催化反应
养基中应不采用葡萄糖等容易利用的碳源。
④添加表面活性剂。导致CAMP的生成受阻，使CAMP-CRP的浓度降低，不能结合P的位置，E无法合成。如吐温（Tween）和特里顿（Triton）可靠在细胞膜上，增加细胞的通透性，有利于酶的分泌可增加产酶量。这一措施适应于胞内酶的生产，酸性proE若是胞外酶，则不适用。
⑤添加产酶促进剂。是能增加产酶量，但机理尚不清楚的一类物质。添加植酸钙镁，可促进黑曲霉酸性蛋白酶的生产。
⑥诱变育种。a、调节基因实变，使其失去产生阻遏pro的能力；b、操纵基因变异，使其失去与阻遏物结合的能力。
22、动物细胞培养和发酵所得动物功能蛋白有哪些？
23、画出分批搅拌罐式反应器和连续搅拌罐式反应器的示意图，说明它们在操作上的异同？
操作异同：P179
24、什么是反应器放大？有哪些放大方法？ 定义：
放大方法： （一）、经验放大法
几何相似放大；单位体积液体搅拌功率相同放大；混和时间相同准则。 （二）、其它放大方法
因次分析法；时间常数；数学模拟法。
27、分析说明修饰酶的性质。
①热稳定性 一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性。
②体内半衰期 经过化学修饰后很多酶的抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳定性都有增加和提高，也就相应提高了酶在生物体内的半衰期，这一点对提高药用酶的疗效至关重要。
③修饰酶的抗原性 有抗原性的天然酶可以通过化学修饰使酶分子中的一些组成抗原决定簇的基团与修饰剂之间通过共价键相互结合，从而破坏了酶分子中抗原决定簇的结构，进而使天然酶的抗原性降低，甚至完全消除。大分子的修饰剂还有可能起到“遮盖”天然酶上的抗原决定簇以阻碍抗原与抗体之间的结合反应。但有些修饰剂在降低和消除天然酶的抗原性上并没有作用。 目前比较公认的在消除或降低天然酶抗原性的修饰剂主要有PEG和人血清白蛋白。
④最适pH 部分酶经过化学修饰后，其催化的最适pH会发生变化，修饰酶的最适pH与天然酶的最适pH相比往往不同，且有些酶的最适pH会有一定的范围，更适合于酶的应用，尤其是在生理或临床应用上有较大的意义。 ⑤酶学性质的变化 天然酶经过修饰后，绝大多数酶的最大反应速度Vmax没有变化，但有些酶被修饰后，其米氏常数Km会增大
⑥对各类失活因子的抵抗 化学修饰酶与天然酶相比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高
28、什么是抗体酶？抗体酶的制备方法有哪些？
31、非水介质反应体系有哪些特点？作为非水介质，应具备哪些条件？
33、任选一酶，解释其分类和性质。综述其制备工艺。包括提取工艺过程和微生物发酵生产过程。对微生物发酵生产过程，说明菌种，发酵条件，分离纯化工艺。综述该酶的主要应用情况。