真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定

675-678广西农业科学2010,41(7):

GuangxiAgriculturalSciences

·675·

真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物

病原真菌的拮抗活性测定

(1广西大学农学院,南宁

茜1,2,胡春锦2,3,黄思良4*,柯仿钢1,黎起秦1

530007;3广西作物遗传改良生物技术重点开

473061)

530007;4南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳

530005;2广西农业科学院微生物研究所,南宁

放实验室,南宁

摘要:针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害,对柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等作物根际土壤进行拮抗菌筛选试验。结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株,其中有拮抗作用的34株,平皿拮抗效果较好的16株;再经复筛,得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55;对峙培养试验表明,Bs55菌株对12种常见病原真菌具有较强的抗菌活性,抑菌率最高达87.7%。拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖、抑菌谱广等特点,是具有较好利用前景的生物防治材料。

关键词:Bs55菌株;枯草芽孢杆菌;病原真菌;拮抗活性中图分类号:S476+.1

文献标识码:A

文章编号:1002-8161(2010)07-0675-04

Screeningofantagonisticbacteriaagainstfungaldiseasesanddeterminationoftheirantagonisticactivitytovariousplant

pathogenicfungi

WANGQian1,2,HUChun-jin2,3,HUANGSi-liang4*,KEFang-gang1,LIQi-qin1

(1AgriculturalCollege,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2MicrobiologyResearchInstitute,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China;3GuangxiCropGeneticImprovementandBiotechnologyLab,Nanning530007,China;4CollegeofLifeScienceandTechnology,NanyangNormalUniversity,Nanyang,Henan473061,China)

Abstract:Inordertofindouttheantagonisticbacterialagentsagainst12kindsofcropfungaldiseasesoccurringcommonlyinGuangxi,screeningexperimentswerecarriedoutusingbacteriafromrhizosphericsoilofcitrus,banana,sug-arcane,pepperandsomemedicinalplants.Thestudiesresultedinisolationof386strainsfromrhizosphericsoilofdifferentcrops.Amongthese,34strainsshowedantagonisticactivityand16strainsshowedgoodantagonisticeffectsonplate.Aftersecondaryscreening,antagonisticbacterialBs55wasscreenedoutwithstronginhibitoryeffectoncitrusanthracnose.Con-frontculturetestsshowedthatBs55strainhadstrongantifungalactivityto12kindsofcommonpathogenicfungis,thehigh-estinhibitingratereached87.7%.Ithasthecharacteristicsofstrongantagonismandlargescalepropagation,andwasap-provedtobeapromisingbiocontrolagentwithabroad-spectrumbiocontrolpotential.

Keywords:Bs55strain;Bacillussubtilis;pathogenicfungi;antifungalactivity

真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主要病害[1],给农业生产带来了严重危害。土壤是各种微生物良好的栖息场所,生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。在生防菌株的筛选上,考虑到植物与微生物之间的相互作用关系,人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选,这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力[2]。

本研究针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害,从不同作物根际土壤中筛选拮抗菌,为开发广西微生物资源,筛选与环境相容性好的微生物农药奠定基础。

1

1.1

材料与方法

供试病原菌和培养基

收稿日期:2010-04-19基金项目:广西农业科学院科技发展基金重点项目[2007007(Z)]作者简介:汪茜(1984-),女,湖北武汉人,硕士研究生,研究方向为真菌学及植物真菌性病害防治。*为通信作者,E-mail:silianghuang@

126.com。

·676·

广西农业科学

供试病原菌有柑橘炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.]、水稻纹枯病菌(Rhi-zoctoniasolaniKühn)、玉米大斑病菌[Exserohilumturcicum(Pass.)Leonard&Suggs]、玉米小斑病菌[Cochliobolusheterostrophus(Dreschl.)Dreschl.]、茉莉白绢病菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)、辣椒炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.]、香蕉炭疽病菌[Colletotrichummusae(Berk.&Curt)Arx]、冬瓜疫霉(PhytophthoradrechsleriTucker)、龙眼链格孢黑斑病菌[Alternariaalternata(Fr.)Keissler]、香蕉大灰斑病菌[Curvularialunata(Wakker)Boedi-jin]、香蕉叶缘枯斑病菌(AlternariamusaeBour.etBat)、杨桃炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.]等12种,均由广西农业科学院微生物研究所保存、提供。菌株在PDA培养基上28℃活化

培养后供试。

拮抗菌分离培养基采用NA培养基[3](牛肉浸膏

10g、蛋白胨5g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL,

pH7.0~7.2),拮抗菌筛选培养基采用PDA培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂15g、水1000mL)。1.2拮抗菌的分离

从广西农业科学院、南宁市金陵镇、金光农场、广西大学农场和广西药用植物园等地采集柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等不同种类作物根际土壤,分别称取土壤10g,放入90mL有玻璃珠的无菌水三角瓶中,200rpm摇匀20min,制成土壤悬浮液,梯度稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。用接种环从10-3、

10-4悬浮液中各沾取1环,分别在平板上划线[4],于28℃下倒置培养,48h后观察,挑取不同形态单菌

落,纯化后保存,待测。

1.3拮抗菌的筛选

1.3.1初筛以柑橘炭疽病菌为测试菌进行拮抗菌初筛。将直径5mm的病菌原菌块置于PDA平板中央,在其周围4个等距离位置上分别点接4种不同的细菌,每处理3次重复。培养3~5d后,观察不同细菌是否对致病菌生长有抑制作用及抑菌带的大小(取

3次重复的平均值),并按抑菌圈半径的大小将拮抗菌分为强、中、弱三类,抑菌圈半径>10mm为强,5~10mm为中,<5mm为弱。

1.3.2复筛将有抑菌作用的菌株作进一步筛选。采用平板对峙法[5],在培养皿中央接种培养7d的柑橘炭疽病菌菌饼(直径5mm),离该菌饼约3cm处,用接种环沾取培养48h的拮抗菌,在平板对称两侧各划一条细线,28℃培养,以只接种病原菌

的平板为对照,待对照长满皿时测量柑橘炭疽病菌的菌落生长直径,每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率:

菌落生长抑制率=(对照菌落净生长距离-处理

菌落净生长距离)/对照菌落净生长距离×

100%

1.3.3

拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定

采用

平板对峙法,将菌株Bs55在PDA培养基平板上划线,距划线处4cm接种病原菌菌饼(直径5mm),

28℃培养,以仅接种病原菌的平板为对照,待对照

长满皿后测量病原菌的生长直径,计算抑制率。每处理重复3次。

2结果与分析

2.1

拮抗菌的分离筛选

从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株,其中有拮抗作用的34株,平皿拮抗效果较好的16株;再经过复筛,得到一株拮抗活性最强的细菌Bs55。Bs55分离自广西药用植物园鸡血藤根际土壤,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

以柑橘炭疽病菌为单一靶标菌与所有分离菌株进行对峙培养,结果显示,不同类群的微生物出现拮抗菌株的频率各有不同,其中25株放线菌中有4株对柑橘炭疽病菌具拮抗作用,拮抗菌株检出率为16.0%(表1);不同类别作物根际分离物中拮抗菌的检出率也不同,其中甘蔗根际拮抗菌株的检出率最高,为12.5%,其次为柑橘9.7%,玉米根际的拮抗菌检出率最低,为3.1%(表2)。

表1不同类群微生物中拮抗菌株的检出率

Table1Detectionrateofantagonisticstrainsindifferentgroupsofmicroorganism

微生物类群测试菌株数拮抗菌株数

NumberoftestNumberof

比率(%)

Microbegroupstrainsantagonisticstrains

Percentage

细菌Bacteria356308.4放线菌Actinomycete25416.0真菌Fungi

5

表2不同类别作物根际拮抗菌株出现频率

Table2Occurrencefrequencyofantagonisticstrainsincroprhizosphereofdifferentcrops

作物类别分离菌株数拮抗菌株数拮抗菌株出现率(%)CropcategoryNumberofNumberofOccurrencefrequencyisolatedstrainantagonisticstrainofantagonisticstrains

柑橘Citrus6269.7香蕉Banana4848.3甘蔗Sugarcane64812.5辣椒pepper5036.0玉米Maize3213.1

药用植物

Medicinalplants

130

12

9.2

汪茜等:真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定

·677·

2.2

拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定

采用平板对峙法检测Bs55对12种病原真菌的

抑制效果。结果显示(表3),Bs55菌株对供试的12种病原菌表现出较高的抑菌活性,抑菌率在59.9%~

87.7%之间,表明生防菌Bs55对不同病原真菌的抑菌力虽然存在明显差异,但有较广的抑菌谱。Bs55菌株对部分病原真菌的抑菌效果见图1。

A:柑橘炭疽病菌;B:玉米小斑病菌;C:玉米大斑病菌;D:香蕉大灰斑病菌A:C.Gloeosporioides;B:C.heterostrophus;C:E.turcicum;D:C.LunataFig.1

图1Bs55菌株对部分病原真菌的抑制作用

InhibitoryeffectsofBs55strainagainstsomepathogenicfungi

表3Bs55菌株对12种植物病原真菌的抑菌率

Table3InhibitoryratesofthestrainBs55against12kindsofplantpathogens

病原菌Pathogen柑橘炭疽病菌C.gloeosporioides水稻纹枯病菌R.solani

玉米大斑病菌E.turcicum玉米小斑病菌C.heterostrophus辣椒炭疽病菌C.gloeosporioides茉莉白绢病菌S.rolfsii

香蕉炭疽病菌C.musae

杨桃炭疽病菌C.gloeosporioides香蕉大灰斑病菌C.lunata冬瓜疫霉P.melonis

香蕉叶缘枯斑病菌A.musae

龙眼链格孢黑斑病菌A.alternate

抑菌率(%)差异显著性SignificantdifferenceInhibitoryrate5%1%

87.787.177.461.386.386.686.364.259.985.979.574.9

aacfaaaefabd

AABEAAADEABC

3结论与讨论

微生物在自然界的分布非常广泛,地球上除了

火山区域外,无论是土壤、空气、水、枯枝烂叶、植物病株、腐烂果实等都含有众多微生物[7~9]。Filonow等[10]不从苹果上分离拮抗菌,而以从其他生境如空气、土壤、海水、叶片、大蒜等上分离到的28种酵母为材料,筛选到能有效防治苹果灰霉病的土生隐球酵母(CryptococcushumicolaNRRLY1266)、花状线

黑粉菌(FilobasidiumfloriformeNRRLY7454)、红冬孢酵母(RhodosporidiumtoruloidesNRRLY1091)、掷孢酵母(SporobolomycesroseusFS-43-238)等几种酵母。可见,拮抗菌的筛选不是教条的,只要有抑菌效果且无害,都可以利用。

枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在[11~13],对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力,克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点,具有选择性强、安全、原料简单等优点[14~18]。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可,它们分别是GBO3、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢杆

注:抑菌率为3次重复的平均值;大、小写字母分别表示1%和5%水平上的差异显著性。

Note:Valuesofinhibitoryratesareaverage;differentcapitalandsmallalphabetsinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceat0.01and0.05level,respectively.

·678·

广西农业科学

菌变种(B.subtilisvar.amyloliquefaciensFZB24),其中生物杀菌剂QST713为AgraQuest公司产品,商品名为Serenade,主要用于防治水果采收前后病害[19]。我国林开春等

[20]

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[11]ObagwuJ,KorstenL.Integratedcontrolofcitrusgreen

公布的含有枯草芽孢杆菌CCTC

[21]

CM204085的防腐保鲜剂(公开号:1853489)在果实

采后防腐保鲜方面的应用效果较好。杨佐忠等达到了较好的防腐保鲜效果。

用枯草芽孢杆菌PRS5处理采后的苹果和脐橙,也

本研究从所采集土样中分离纯化出的386株菌株中,通过多步筛选,得到对12种病原真菌抑制效果最强的枯草芽孢杆菌Bs55作为目标拮抗菌。Bs55对12种病原真菌均表现出显著的抑制作用,抑菌率均在59.9%以上,最高达87.7%,具有广谱抑菌活性,但对病原真菌的抑制力各有侧重。目前有很多关于利用生防细菌防治植物真菌病害的报道,但从整体上看主要存在防治谱窄的问题[2]

。另外,生防菌发挥生防作用还涉及其在不同土壤环境中的定殖。本研究从广西红壤土类型、气候条件、强紫外线条件下筛选出的拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖等特点,其菌株本身具有广谱生防潜力,是有较好利用前景的生物防治材料。因此,生防菌Bs55具有很好的工业开发前景和应用价值,有必要对其菌株本身及其抑菌机理进行深入研究。

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(责任编辑麻小燕)

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