双水相萃取地豆蛋白实验设计方案
史庚林
一、引言
地豆又名金果，长寿果、长果、番豆、金果花生、无花果、地果、地豆、唐人豆、花生豆、落花生和长生果。花生滋养补益，有助于延年益寿，所以民间又称之为“长生果”，并且和黄豆一同被誉为“植物肉”、“素中之荤”。花生的营养价值比粮食高，可以与鸡蛋、牛奶、肉类等一些动物性食物媲美。它含有大量的蛋白质和脂肪，特别是不饱和脂肪酸的含量很高，很适宜制作各种营养食品。
双水相萃取系统通常是由水溶性的两种聚合物或一种水溶性聚合物与一种盐和水构成的三组分双相体系。近年来, 该萃取技术受到研究者的青睐, 尤其是它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化等方面受到广泛重视, 双水相萃取在提取生物活性物质方面有如下优点: 含水量高; 分相时间短; 界面张力小; 不存在有机溶剂残留问题; 大量杂质能与所有固体物质一同除去; 易于工程放大和连续操作 ; 更重要的是双水相萃取避免了传统液- 液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触, 保护了其活性, 有研究表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用, 反而有稳定作用。
本实验以PEG/ ( NH4) 2SO 4 双水相体系为考察对象, 比较了不同浓度的PEG 和( NH4 )2 SO 4 组成的双水相体系对地豆蛋白的萃取效果, 并考察了影响萃取效果的各种因素。 二、实验仪器与试剂
1 仪器：离心机, 电热恒温水浴锅，分光光度计, 磁力搅拌器，电子天平，超声波仪
2 试剂：PEG( 分子量分别为600、1000，2000、4000、6000) , 硫酸铵，Nacl ，NaH 2PO 4 ，K 2HPO 4，考马斯亮蓝（G-250） 三、方法 1 粗蛋白的提取
1.1 用前面超声波处理的方法提取蛋白质 1.2 用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量
2 不同分子量PEG 的双水相萃取的相图作
用浊点法制作相图。称取2g50%PEG溶液，加1mL 蒸馏水，计总质量。向体系中加40%（NH 4) 2SO 4至浑浊，测质量，然后再加1mL 蒸馏水，溶液马上澄清，重复前面步骤，测出多组数据，作出相图。
表1 相图的制表
编号 H 2O 加量/g 1 2 3 4 5 6
0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5
( NH 4) 2SO 4溶液的加量/g
纯( NH4) 2SO 4 溶液的累累积量/g
积量/g
PEG 质量分数/%
( NH4) 2SO 4质量分数/g
取分配系数好的PEG 的相对分子质量 3 单因素实验
3.1 在PEG/ ( NH4 )2SO4 双水相系统中, PEG 浓度对地豆蛋白质分配系 数的影响
表2 在PEG/ ( NH 4 ) 2 SO 4 双水相系统中, PEG 浓度对K 的影响 PEG 溶液加量/g 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5
（NH 4 )2SO 4溶液
加量/g 5 5 5 5 5 5 5 5 5
蛋白溶液加量
/g 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0
分配系数K
体积比R 萃取率Y
取最佳PEG 的浓度
3.2 在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中,( NH4 ) 2SO 4 浓度地豆蛋白质分配系 数的影响
表3 在PEG/ ( NH 4 ) 2 SO 4 双水相系统中, ( NH 4 ) 2SO 4浓度对K 的影响 PEG 溶液加量/g
5 5 5 5 5 5 5 5 5
（NH 4 )2SO 4溶液
加量/g 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5
蛋白溶液加量
/g 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0
分配系数K
体积比R 萃取率Y
取最佳( NH 4 ) 2SO 4浓度
3.3 在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中, pH 对地豆蛋白质分配系数的影响 固定PEG 的百分含量为 ,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为 , 考察不同pH 对 蛋白质分配系数的影响。
表4 pH 蛋白质分配系数的影响
PH 值 2 4 6 8 10
分配系数K
体积比R
萃取率Y
3.3 在PEG/ ( NH4 ) 2SO4 双水相系统中, NaCl质量分数对 地豆蛋白质分配系数的影响
固定PEG 的百分含量为 ,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为 , pH
为 , 考察不同质量分数NaCl 对果胶酶分配系数的影响。
表5 NaCl质量分数对地豆蛋白质分配系数的影响
NaCl 溶液加量/g 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010
PEG/ ( NH4 ) 2SO 4
溶液加量/g
5 5 5 5 5
蛋白溶液加量/g 4.998 4.996 4.994 4.992 4.990
分配系数K
体积比R
萃取率Y
3.4 在PEG/ ( NH4 ) 2 SO4 双水相系统中, 体系温度对 地豆蛋白质分配系数的影响
固定PEG 的百分含量为 ,( NH4 ) 2 SO4 的百分含量为 , 考察不同温度对果胶酶分配系数的影响。
表5 温度对K 的影响
温度/℃ 2O 40 60 80 100
参考文献：
【1】刘叶青. 生物分离工程实验[M].78-79
【2】邱树毅. 液-液双水相萃取分离α-淀粉酶研究[J].食品科学, 2000, 21( 9) : 12-14.
【3】杨 辉，张 娟，王 旭.PEG/(NH4)2SO4 双水相体系萃取果胶酶[J],食品科学,2007,124-125.
分配系数K
体积比R
萃取率Y