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新型荧光物质—量子点在生命科学领域的应用研究进展
陈伟 沈鹤柏 陈艳 周丽佳 徐文涛
（上海师范大学生命与环境科学学院， 上海 200234） *
摘 要 半导体荧光量子点因其特有的荧光性质而成为生命科学领域生物标记材料研究的前沿内容。本文综述了高荧光效率量子点的各种制备方法以及在生命科学领域应用的研究进展。
关键词 荧光材料 量子点 生物标记 活体标记 生命科学
New Fluorescence Material—Quantum Dots and the Applying in Life Science
Chen Wei， Shen Hebai *， Chen Yan ， Zhou Lijia ， Xu Wentao
(Life and Environment Science College, Shanghai Normal University, Shanghai 200234)
Abstract Fluorescence semiconductor nanocrystals (quantum dots) have been paid great and wide attention in the fields bioimaging material of life science, because of their special fluorescence character. The studying progress in different preparing methods of quantum dots and the applying in the fields of life science is briefly reviewed in this paper.
Key words Fluorescence materials, quantum dots, bioimaging, in vivo imaging, life science
量子点（quantum dots），又称半导体纳米微晶粒（semiconductor nanocrystal），通常是由ⅡB 和ⅥA族元素组成，目前研究较多的主要是CdX（X=S、Se、Te）。通常量子点的研究粒径范围为2～20nm，电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因而在受到光激发或电压后能产生荧光发射。量子点作为新型的荧光材料与传统的有机染料荧光物质相比较主要有以下几个方面的优点
[1～3]：（1）量子点是无机半导体荧光材料，其激发谱为连续谱带，用高于带隙能量的光均可以激发，且
[4]发射谱较窄，半峰高宽通常为30nm 左右（见图1）；（2）量子点的光稳定性要远高于传统的有机染料
分子，经过表面包覆的量子点其抗光漂白能力和光稳定性更是进一步提高；（3）量子点可以通过调整其自身的尺寸来得到不同颜色的发射荧光（见图2）。
[5]
图1有机荧光素(A)和CdSe 量子点(B)的荧光光谱[4]
Fig. 1 The fluorescence spectrum of Organic dyes (A) and CdSe quantum dots [4]
图2六种不同颜色量子点的荧光照片图[53]
Fig.2 The fluorescence photo of different colour quantum dots [53]
1．量子点的制备
量子点自身的优点使其相关的合成方法也显得尤为重要。量子点的合成的研究目的最初是为了得到单分散性好的纳米粒子，以便对其量子尺寸效应进行深入的研究。到目前为止，有关量子点的合成方法有很多，然而根据所采用原料和工艺的不同，概括起来大致可分为金属化合物－元素有机物路线和水相无机合成路线。Peng等在量子点的有机合成方面做出了大量突出而细致的工作，为推动以半导体荧光量子点为基础的理论和应用研究做出了重要贡献[6～11]。Peng等以CdO 取代Cd（CH3）2形成配合物，作为Cd 的反应前体，得到高质量单分散的CdSe。Peng小组还进一步对合成方法进行改进，选取合适的镉盐和磷酸氧化物配体，通过一步法成功得到了1.5～25 nm 的单分散CdSe。经过不断的改进，Peng小组发展的这种合成方法已经可以用于商业化的Ⅱ-Ⅵ 量子点的合成。庞代文等[12～17]在文献报道的基础上[8]
进行改进，在相对温和、安全的条件下对其进行包裹，制备了CdSe/CdS,CdSe/ZnS等核/壳结构量子点，此方法所使用的原料稳定、易于储存、价格低廉、操作安全简便，使实验室大规模制备成为可能。量子点在有机体系中的生长温度可以在较大范围内选择调节，从而有利于量子点的成核和生长的控制。同时Peng 等和Weller
等又在有机相合成量子点的基础之上
将有机相转移到了油相，从而得以在生物领域进行应用
的另一重要途径。Weller等[25,26][18～24]。直接水相合成是量子点制备和高明远等[27～31]在这方面的工作较为特出。他们采用巯基化合物如巯基乙酸、3-巯基丙酸等作为纳米粒子的稳定剂，巯基通过和粒子表面的镉原子配位来控制粒子的增长，同时提供稳定的电荷层保证分散体系的稳定性，选用不同的巯基化合物可方便地调节粒子表面的性质，得到不同用途的CdTe 量子点。此外，巯基在表面镉原子的配位使CdTe 表面形成一层钝化层，形成自然的核壳结构，通过光氧化可以使该结构更完整，从而获得高的荧光量子产率（室温量子产率在40％左右）。水相合成有很多优点：（1）采用水为合成介质，更接近绿色化学的标准；（2）普通的盐为原料，制备成本为有机法的1/10；（3）合成方法简单，无需特殊的无氧无水设备，一般的合成实验室能够制备，且可以批量生产；（4）无需进一步的表面亲水修饰即可以应用于生物荧光探针研究
其他一些进一步提供量子点性质的研究。Nie等[33][32]。此外，还有和Han 等[34,35]分别报道了合金型量子点的合成。这种合金型量子点显示非线性光学性质，发射波长高于单独的量子点，处于近红外区，具有很高的穿透性，可以作为生物体内组织标记材料。该类型的量子点更为重要的一个特性为在室温条件下，有着非常窄的发射光谱，仅为14～18 nm，接近单粒子荧光峰的宽度。
2．量子点在生命科学中的应用
在生命科学领域，荧光图像技术是一种重要的手段，然而由于有机染料易于淬灭，无法对标记物进行长期的追踪及观察标记物的动力学过程。荧光蛋白的出现可以在一定程度上解决这一问题，但需使用基因工程技术制备可表达融合蛋白的质粒，进行细胞培养、基因转染等一系列操作，不易普及。量子点的出现，以其独特的优点，吸引生命科学家的注意，比较彻底地解决上述存在的问题。
2.1量子点的生物标记
1998年Alivisatos 等和Nie 等[4][36]同时在《Science》发表相应的研究成果，最早提出了量子点作为生物标记物的思想，他们的工作充分显示了量子点作为一种新型的荧光试剂，完全可以取代传统的有机染料，其优异的荧光性能将为生命科学技术带来新的突破，从而拉开了量子点在生命科学中应用的序幕。Alivisatos用两种不同大小（2 nm 和4 nm）的二氧化硅包裹的CdSe/CdS量子点作探针，标记术3T3成纤维细胞，生物分子通过静电和氢键或配体-受体与量子点表面相互作用而结合，从而实现标记。发绿色荧光的量子点结合到细胞核，发红色荧光的量子点结合到肌动蛋白丝上，同时在细胞中观察到红色和绿色的荧光(见图3)。Nie 等用巯基乙酸处理的CdSe/ZnS量子点与转铁蛋白结合，通过受体介导发生内吞作用，将量子点转运到HeLa 细胞中，进行HeLa 的标记，说明连接了荧光量子点的转铁蛋白仍然具有活性。同时他们还将CdSe/ZnS量子点与人IgG 结合，再与特异性抗人IgG 多克隆抗体孵育后，产生广泛的凝集反应，表明量子点标记免疫分子后能识别特异性抗体或抗原用于免疫化学研究（见图4）。
2003年Bruchez [37]发展了荧光量子点表面修饰的方法，通过量子点与具有特异性识别作
用的IgG 或亲和素连接成了特异性免疫荧光探针，系统地研究了针在亚细胞水平上的标记效率，首次高分辨地观察到了细胞结构。同年Dehan 等
图3双色量子点标记单个细胞不同组分的荧光成像
Fig. 3 Fluorescence micrographs of dual-colour quantum dots stained 3T3 mice fibroblast cells [4] [4][38]用荧光量子点标记了神经细胞表面的
图 4 抗体引发的量子点标记的人IgG 团聚现象[36]。
Fig. 4 Antibody-induced agglutination of QDsthat were labeled with human IgG.
（A）在BSA 存在的条件下量子点标记的人IgG 的荧光照片。（B）抗体存在的条件下量子点标记的人IgG 团聚物的荧光照片 抑制性神经传递素受体，实时观察了单个荧光量子点的运动情况，首次实现了量子点在活细胞体内单分子水平上的标记，跟踪并分析了单个神经传递素受体在神经细胞膜上的扩散动力学过程，并用电子显微镜成像证实了这一过程。该方法依靠量子点，用荧光成像和电子显微镜成像可以同时获得瞬时动力学信息和高分辨细胞定位信息，为在单分子水平上研究细胞动力学提供了一个强有力的手段。
2.2量子点在活体成像方面的应用
在量子点生物标记应用的基础上，人们开始将量子点应用于活体成像。2002年，Akerman 等[39～47]将肽与量子点结合用于标记特定组织部位的内皮细胞受体。通过静脉注射将连有肽片段的量子点注入到小鼠体内，可以观察到量子点在特定的目标组织部位聚集，从而实现体内组织的可视化(见图5)。
图 5量子点用于小鼠体内的癌细胞活体标记
Fig. 5 In vivo targeting and imaging of cancer cells in mouse [5]
[5]
Dubertret 等[48]用磷脂嵌段共聚物囊泡包覆量子点制备得到量子点-囊泡材料。他们将这种量子点-囊泡材料注入到非洲瓜蟾（Xenopus）的单个早期胚胎内，观察胚胎的发育过程。研究结果表明当荧光量子点注入到双细胞胚胎中的一个细胞时，量子点自动限制在该注入细胞的子代中。在被注入量子点的细胞子代胚胎发育形成分裂球的发展过程中，量子点仍类似地限制在注入细胞的子代中。实验结果同时还表明所制备的量子点-囊泡材料几乎不存在毒性，胚胎能正常发育，从而可以跟踪观察细胞的分裂过程和分辨胚胎发育过程中的世系关系（见图6）。
图6量子点标记瓜蟾胚胎在发育不同时期的照片[48]
Fig. 6 The scheme and photos of quantum dots labeling embryo in different stages [48]
3.3生物分析监测
荧光量子点除了应用与上述的生物标记以及活体成像领域外，在生物分析监测领域也起着不可忽视的作用。Goldman等[ ][49]将工程重组蛋白质通过静电作用结合到CdSe-ZnS 核壳型荧光量子点上，然后再与抗体相连接，用于荧光免疫分析。使用这种制备的荧光探针，成功地对葡萄球菌产生的毒素B 和2，4，6-三硝基甲苯节能型了免疫荧光分析。后来该小组又用不同粒径CdSe-ZnS 量子点对霍乱、蓖麻毒素、类志贺病毒、葡萄菌肠毒素B 四种病毒同时监测。通过荧光波长和荧光强度可以获得样品中的病毒种类和含量，完成对同一样品中不同病毒蛋白的同时监测分析的任务。
在传感器方面量子点也有着十分重要的应用。化学传感器方面，Nazzal等[50]将CdS 量子点固定在薄膜中，发现许多气体可以对这种薄膜发生快速的可以的响应，荧光强度可以增强或淬灭，表明基于不同种类和尺寸的量子点的传感器可以对多种气体同时进行快速检测。应用荧光共振能转移原理（FRET）可以将量子点用于生物传感器。量子点作为FRET 的供体，引起可以调节的发射谱可以满足任何受体的需要，其宽广的激发谱便于选择不直接激发受体的激发光[17]。Willard等[51]将生物素标记的牛血清白蛋白连接到CdSe/ZnS表面，使之特异性地与四甲基罗丹明（TMR）标记的亲和素作用，观察到荧光量子点以TMR 之间有荧光共振能量转移现象的发生，导致染料荧光增强。若发生的是非特异性作用，
则不能观察到染料荧
光增强的现象。该实验的成功表明基于量子点的FRET 在监测抗原-抗体作用，DNA杂化等方面有着重要的实际应用前景。
量子点另外一个重要的应用前景在于将不同数量、不同荧光发射色的荧光量子点组合，可以实现多色编码技术。根据计算可知，只需5～6种颜色结合6种发光强度的荧光量子点进行不同组合得到的荧光量子点微粒就可以形成10000～40000个可以识别的编码。如果增加发光强度的变化到10种，则可以提供100万个可以识别的编码，理论上就可以对100万个不同的DNA 或蛋白质进行编码。Han等[52]进行了这方面的开创性的工作，他们巧妙地将不同数量不同荧光发射色的荧光量子点组合后装进聚苯乙烯微球中，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的可标记到生物大分子上的微粒。在模拟实验中利用这些制备的微粒在混合的DNA 试样中进行检测，准备了3种颜色的微粒，并将他们连接到遗传物质的条带上，每种颜色对应一个特殊的DNA 序列。在已知DNA 与用染料标记的未知DNA 进行杂交后，通过染料分子可以判断出杂交成功，通过光谱可以读出每种荧光量子点的发光强度的比例关系，从而可以判断出所连接的DNA（见图7）。
图7 基于波长和强度复合的光学编码在DNA 杂交检测中的应用[52]
Fig. 7 Schematic illustration of DNA hybridization assays using QD-tagged beads [52]
3．结语
综上所述，荧光量子点的出现不仅是现有荧光物质的补充，在某些方面已经优于传统的荧光材料，量子点本身在以及通过一定的修饰与生物分子连接起来形成的复合物在生命科学领域的应用也显示出了一定的优势。但在今后一定的时期以内，荧光量子点还不可能完全取代传统的荧光材料。因为相对于量子点来说，
传统的荧光材料技术更为成熟且已经得到了反
复的实践证明和广泛的实际应用。量子点在生命科学领域的应用还需要大量更为细致的工作,要求重复性好、可信性高，而且要求操作更为简洁方便。要建立基于量子点的在生命科学领域的检测体系还需要很长的时间。但是纵观量子点发展的简短历程，已经在生物分析和生物成像等方面取得了巨大的发展。因此我们相信量子点在这些方面的发展将会更为迅速和更为深入。量子点荧光技术必将成为生命科学领域举足轻重的一部分。
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