南京农业大学学报２０１ｌ，３４（４）：５９—６４
ｊｏｕｍ越巧Ｎ嘶魄Ａｇｒ证ｕｌｔｕｒｎ王Ｕ幽盯ｓ晒ｈｔｔｐ：／／ｎａｕ】【ｂ．１１ｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ肖同建，陈芳，朱震，等．不同根际细菌对南方根结线虫抑制效果的研究［Ｊ】．南京农业大学学报，２０ｌｌ，３４（４）：５９—６４
不同根际细菌对南方根结线虫抑制效果的研究
肖同建，陈芳，朱震，李蕊，张鹏，冉炜。，沈其荣
（南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，江苏南京２１００９５）
摘要：采用稀释平板涂布方法从番茄根结土壤中初步筛选出对明胶有水解作用的菌株。通过各菌株发酵Ｅ清液对南方根结线虫二龄幼虫死亡率和虫卵孵化率抑制作用，以及拮抗菌悬浮处理番茄根系３０ｄ后观察番茄根结数量变化，进一步筛选获得高效菌株。通过１６ｓｒＤＮＡ基因序列分析，对能显著抑制根结线虫生长的２株菌株进行了鉴定。结果表明：筛选出了１０株对明胶有明显水解圈的细菌，其中菌株ＢＴＧ和）（５具有较强的明胶水解能力。菌株ＢＴＧ和ｘ５发酵的上清液处理二龄幼虫２４ｈ后的死亡率比无菌｝清液处理死亡率提高了７２．１３％和６２．１４％；而用菌株上清液处理１４ｄ后的虫卵孵化率比无菌上清液处理的孵化率降低了３８．６２％和３０．７３％。菌株ＢＴＧ和）（５的菌悬液处理的番茄根结数比不加菌悬液对照处理根结数分别降低了８０．４９％和７３．１７％。经１６ｓｒＤＮＡ基因序列分析表明，蒴株ＢＴＧ和Ｘ５都属于芽孢杆菌。通过比较各株细菌对二龄幼虫（Ｊ２）死亡率，虫卵孵化率及番茄根结数量的影响，筛选出了２株可用于生物防治作物根结线虫的芽孢杆菌。关键词：番茄；根结线虫；死亡率；孵化率；芽孢杆菌
中图分类号：ｓ９６３．２１＋ｌ文献标志码：Ａ文章编号：１０００—２０３０（２０１１）０４—００５９一０６
ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆＩｅｒｅｎｔｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ（胁肠螂聆Ｐ扬ｃ昭咒妇）ｏｆ
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１【ｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｏｍａｔｏ；ｒｏｏｔ－ｋ∞ｔｎｅｍｔｏｄｅ；ｍｏｒｔａｌｉｔｙｍｔｅ；ｅｇｇｈａｔｃｈｉｎｇｍｔｅ；丑∞珊瑚ｓｐ．
根结线虫严重危害植物生长，导致全世界每年巨额的经济损失和农作物产量下降…。使用化学农药防治根结线虫，不仅经济成本高，而且会污染环境，危害人类健康。利用微生物对植物病原生物进行生物防治，是一种环境友好型防治措施。筛选出能有效防治根结线虫的拮抗菌仍然是当前研究的热点，对于探索微生物与根结线虫的相互作用具有重要的理论和实践意义。关于利用根际细菌资源防治根结线虫也有～些报道【２—７】。将根际促生细菌接种于土壤中，结果发现植物根际的线虫数量，根系中的卵块数和根结数量都有所减少，同时也可以促进植物的生长。根结线虫的外表皮主要成分是由胶原蛋白质组成，同时根结线虫虫卵最外层（卵黄层）也含有蛋白质悼Ｊ。明胶是来源于胶原蛋白质不可逆水解过程的一种变性胶原蛋白。以往研究中筛选出的能水解明胶产胶原蛋白酶的微生物资源绝大多数应用在工业、医学和食品行收稿日期：２０１０一１０—１ｌ
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３００４）；国家８６３计划项目（２０１０ＡＡｌＯｚ４０１）
作者简介：肖同建，博上研究生。＋通讯作者：冉炜，教授，博士，主要从事微生物有机肥和植物营养研究，１－ｅｌ：０２５—８４３９６２１２，Ｅ－眦ｉｌ：砌ｗｅｉ＠ｎｊ舢．ｅｄｕ．ｃｎｏ
６０南京农业大学学报第３４卷业中阻１３１，但是利用该微生物资源来防治植物根结线虫报道甚少。因此本研究旨在筛选出能以明胶作为氮源的产胶原蛋白酶的并能抑制线虫生长的拮抗细菌，为进一步开发和利用该类微生物资源防治根结线虫及其机制研究提供理论依据。
１材料与方法
１．１菌株的筛选
１．１．１土样的采集用于筛选根结线虫拮抗菌的土壤样品采自江苏省盐城市和金坛市种植番茄以及浙江省金华市种植苦瓜的根结线虫危害严重的地块，选择生长正常且无明显根结线虫侵染的植株，用土铲除去２—３ｃｍ的地表土，拔出整个植株，抖去松散附着在根系上的土体土壤，保留与根系紧密结合的土壤，装入采样袋中带回实验室，４℃冰箱保存备用。
１．１．２菌株生长条件与培养基分离培养基：１０．０ｇ・Ｌ。１明胶，５ｇ・Ｌ。１蛋白胨，０．５
Ｌ－１ＭｇＳ０４・７Ｈ２０，１５．０ｇ・Ｌ—Ｋ：ＨＰＯ。，Ｏ．２ｇ・ｇ・Ｌ＿１
ｇ・ｇ・Ｌ－１琼脂，ｐＨ７．Ｏ～７．２；３０℃培养２４ｈ。种子培养基：５．０ｇ・Ｌ－１肉牛膏，５．０
ｇ・Ｌ“Ｍｇｓ０４・７Ｈ２０，ｐＨ蛋白胨，５．０
培养４８ｇ－Ｌ．１ＮａＣｌ，ｐＨ７．０—７．２；１７０ｒ・ｍｉｎ～、３０℃培养２０ｈ。发酵培养基：ｌＯ．０ｇ・Ｌ。１葡萄糖，２．ＯＬ－１酵母粉，４．０ｇ・Ｌ－１蛋白胨，１．０ｈ。ｇ・Ｌ＿１Ｋ２ＨＰ０４，０．５７．０～７．２；１５０ｒ・ｍｉｎ一、３５℃
１．２菌株的分离与纯化
称取采集的新鲜土壤样品ｌｇ，与９ｍＬ无菌水在振荡器上振荡３０ｍｉｎ，使其充分混匀。采用平板稀释涂布的方法，使各个菌落均匀分布于明胶培养基平板上，恒温培养箱３０℃培养２４ｈ，挑起有明显水解圈的菌落，并进一步划线纯化，最后将得到纯化的菌落置于４℃保存。
１．３上清液的获得
将液体发酵培养基１１５℃灭菌３０ｍｉｎ，种子液以２％（体积分数）接种量接种于装有１００ｍＬ发酵培养基的５００ｍＬ三角瓶中，在摇床上１５０ｒ・ｍｉｎ～、３５℃培养４８ｈ，然后５０００ｒ・ｍｉｎ。１离心２０ｍｉｎ，除菌体，取上清液并用沃特曼ｌ号滤纸过滤除菌后，再用ｏ．２２斗ｍ滤膜抽滤再次除菌，过滤液用作Ｊ２死亡率和虫卵孵化率试验。此外，将各菌株在３５℃、１５０ｒ・ｍｉｎ一条件下培养３０ｈ后，５０００ｒ・ｍｉｎ一离心２０ＩＩｌｉｎ，弃上清液，菌体用无菌水悬浮成同样体积（１．１×１０ＣＦｕ・ｍＬ。１），用于温室番茄试验。
１．４上清液对二龄幼虫（Ｊ２）和虫卵孵化率的影响
１．４．１根系中二龄幼虫和虫卵的提取发病土壤采集自江苏省宜兴市陆平村南方根结线虫严重发病地块。温室盆钵条件种植番茄富集根结线虫。培养４０ｄ后，用自来水冲洗线虫侵染的根系上的泥土，ｌ％过氧化氢表面消毒２ｍｉｎ，向带有大量根结的番茄根系中加入适量的无菌水用豆浆机打碎５ｓ后，倒入双层湿筛（１６０目和４００目）中并用无菌水冲洗，收集下层筛的虫卵和二龄幼虫，离心后获得大量虫卵，并在解７剖镜下用移液器吸取一定数量的虫卵备用。利用贝尔曼漏斗法收集大量二龄幼虫，从植物根系中提取虫卵卵块和二龄幼虫，并在光学解剖显微镜（４０×）下观察记录¨４＿引。
１．４．２上清液对二龄幼虫死亡率的影响将５ｍＬ各菌株过滤液加入６ｃｍ直径的小培养皿中，每皿加入从番茄根系分离有活力的、并用１％过氧化氢表面消毒的二龄幼虫约１００条，于２５℃黑暗处放置，并每隔２ｈ定时观察线虫活力情况，直到２４ｈ为止。用尖细针刺激虫体，如果虫体不动就记录为死亡，计算死亡率。设置无菌过滤液处理为对照，每处理重复５次。
１．４．３上清液对虫卵孵化率的影响将５ｍＬ各菌株过滤液加入６ｃｍ直径的小培养皿中，再加入约１００条经１％过氧化氢表面消过毒的虫卵，２５℃黑暗培养。以无菌液体培养基为对照。每个处理重复５次，第２天开始观察幼虫孵化数，每隔１ｄ观察１次，记录每个处理线虫孵化的头数，观察到第１４天为止，最后计算虫卵孵化率。
１．５不同菌株对根结线虫侵染番茄的抑制作用
挑选籽粒饱满一致的番茄（｜ｓＤＺ口凡ｕｍ如ｏｐｅ瑙如ｕｍＬ．）种子，品种为合作９０３，用１％次氯酸钠表面消毒２ＩＩｌｉｎ，浸种过夜，２５℃催芽露白后，然后播人塑料育苗盘中，待长到３片真叶时移栽于装有３００ｇ含根结线虫（每克土含５００条）土壤的塑料杯中。每杯中移栽１株番茄，每处理重复１０次，加入各个菌株的悬浮液３．５ｍＬ（１．１×１０７ＣＦｕ・ｍＬ。１）。３０ｄ之后轻轻拔起番茄植株，并用自来水冲洗根系，调查各个不同菌株处理后番茄植株的根结数。以３．５ｍＬ无菌水加入相同的土壤中为对照处理。
第４期肖同建，等：不同根际细菌对南方根结线虫抑制效果的研究６ｌ１．６菌株鉴定
１６ＳｒＤＮＡ基因序列的扩增采用细菌通用引物：正向引物为５’一ＡＧＡＧｌＴｒＧＡＴＣＣ’ｒＧＧＣＴＣＡＧ－３，，反向引物为５’・ＧＧ，Ｉ，】随ＣＣＴＴＧｌｌ隗ＣＧＡｃＴＴ－３’。反应体系（２５斗Ｌ）为：１０×Ｂｕ‰ｒ２．５¨Ｌ，ＭｇＣｌ２２．５卜Ｌ，ｄＮｌｌＰｌ斗Ｌ，正向引物Ｏ．６斗Ｌ，反向引物０．６斗Ｌ，ＤＮＡ１．０斗Ｌ，砌ＤＮＡ聚合酶０．３灿，超纯水１６．５止。ＰｃＲ反应条件为：９４℃４ｍｉｎ；９４℃０．５ｍｉｎ，５２℃０．５ｍｉｎ，７２℃ｌｍｉｎ，３０个循环；７２℃ｌｍｉｎ。得到１６ＳｒＲＮＡ基因片段，连接Ｔ载体，转化ＤＨ５Ｑ菌株，由上海博亚生物公司测序，提交ＮＣＢＩ数据库对比鉴定，用邻接法构建系统发育树。
１．７数据处理
试验数据用Ｅｘｃｅｌ２００３进行数据处理，ＳＰｓＳｌ６．０软件进行数据统计和ＡＮＯＶＡ分析，并用最小显著差法（璐Ｄ）对处理间的差异进行比较。
２结果与分析
２．１不同菌株在明胶培养基中水解围的大小
菌株ＢＴＧ和ｘ５具有较强的水解明胶能力（表１）。菌株ＢＴＧ和Ｘ５菌落直径均较小，而水解圈直径较大，其水解圈直径与菌落直径比值（ＨＣ值）均显著高于其他菌株，分别为４．２９和４．０１。二者表现出高的明胶水解活性，但二者之间没有显著性差异。表ｌ结果也表明，不同菌株利用明胶作为氮源的能力不同，不同菌株在同样的培养条件下，生长速度的快慢与产酶能力大小没有必然的联系。
表ｌ不同菌株菌落直径和明胶水解圈的大小
ＴａｂＩｅ１Ｔｈｅｓｉｚ器ｏｆｃｏｌｏｎｙｄｉ帅ｅｔｅｒａｎｄｈｙｄｍＩｙｚｅｄ
ｇｅｌａｔｉｎｚＯｎｅｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉ啷
菌株菌落直径／ｍｍ水解圈直径／ｍｍＨ（：值
ＳｌｒａｉｎＣｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｚｏｎｅｄｉ锄ｅｔｅｒＶａｌｕｅｏｆＨＣ
ＸＯＡ５．９３±Ｏ．５ｌ州２１．３７±０．２３“３．６２±０．３４“
ＸｌＴ５．６３±Ｏ．３８ｃｄ。１８．５０±０．８９６３．３０士Ｏ．３９ｂ
Ｘ２Ｙ７．３７±０．３９“２０．６７土Ｏ．５８ｂ２．８１±Ｏ．１ｌｃ
：Ｋ４Ｓ７．３３士０．１５６１７．９７士Ｏ．８０“２．４５±Ｏ．１４ｃ
ｘ５６．０３±０．２６。２４．１７±０．２４８４．Ｏ】土Ｏ．２０ａ
Ｘ６Ｚ９．４３±Ｏ．３８４１９．７７±Ｏ．２５。２．１０±Ｏ．０９ｄ
ＳＹ５．４２±Ｏ．１０ｄｅ１４．８５±Ｏ．１５。２．７４±Ｏ．０５ｒ
ＢＴＧ４．８０±Ｏ．２６’２０．５７±Ｏ．２１６４．２９±Ｏ．２３ａ垂《◆
ＢＳＲ５．１８±Ｏ．２０科９．２ｌ±０．４ｌ‘１．７８±Ｏ．０９ｄｅ
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注：１）同一列小同字母表示在Ｏ．０５水平差异显著。Ｖａｌｕｅｓｉｎ
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ｄｉ雎ｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌ．ｎｅｓ啪ｅ鹊ｂｅｌｏｗ．
２）Ｈｃ值＝水解圈直径／菌落直径ＨＣ＝ＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓⅫｅｄｉ舯ｅｔｅｒ／ｃｏｌｏｎｙｄｉ姗ｅｔｅｒ
２．２不同菌株对二龄幼虫死亡率的影响
从图１可知，菌株ＢＴＧ和）【５对二龄幼虫有很强的致死力。与对照和其他菌株处理相比，菌株ＢＴＧ和）（５处理的二龄幼虫死亡率分别为９２．１３％和８２．１４％，而对照的死亡率仅为２０％。其他菌株也均表现出对二龄幼虫有一定的致死能力，但是显著低于菌株ＢＴＧ和）（５菌株的表现。该结果与２菌株对水解明胶能力结果（表１）是一致的。
菌株Ｂ’ｒＧ和Ｘ５能够显著抑制根结线虫虫卵孵化。由图２一Ａ可知，各菌株过滤液对虫卵处理后都表
Ｂ
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图２不同菌株对虫卵孵化率（Ａ）和番茄单株根结数（Ｂ）的影响
ｎｇ・２Ｅ疗ｂｃｔ０ｆｄｉＩ盹抛ｎｔｓ嘣璐蚰ｅｇ萨ｌｌａｔｃｈｉｎｇｒａｔｅ（Ａ）明ｄｍｏｔ－－【Ｉｌｏｔｎｕｍｂｅ玮ｐｅｒｐＩ粕ｔｏｆｔｏ呦ｔｏ（Ｂ）
２．３不同菌株对根结线虫虫卵孵化率和番茄根结数的影响
南京农业大学学报第３４卷
现出一定的抑制作用，菌株ＢＴＧ和）（５处理的虫卵孵化率较低，分别为４３．９７％和５１．８６％。除菌株ＢＳｚ处理外，其他菌株处理的虫卵孵化率均显著低于对照，但抑制效率低于菌株ＢＴＧ和ｘ５处理。
温室盆栽试验（图２一Ｂ）表明，菌株ＢＴＧ和）【５处理能显著抑制根结线虫侵染番茄根。与对照和其他菌株处理相比，菌株ＢＴＧ和）（５处理根结数显著减少，分别比不接菌对照减少８０．４９％和７３．１７％，但菌株ＢＴＧ和）（５处理之间根结数量没有显著性差异。菌株ＢＴＧ和）【５都能够抑制线虫对番茄的侵染，反映了这２株菌对根结线虫具有明显的防治效果。
２．４菌株鉴定结果
从以上筛选结果可以看出，菌株ＢＴＧ和Ｘ５对根结线虫的生长有较强的抑制作用。对这２株菌的形态观察和生理生化测定结果表明，２株菌都是革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，并产芽孢；水解淀粉，产过氧化氢，硝酸还原均呈阳性；水解纤维素呈阴性；初步鉴定为芽孢杆菌属菌株（觑谢础ｓｐ．）。菌株ＢＴＧ和）（５
ｂｐ。将２株菌的１６ＳｒＤＮＡ基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ中芽
孢杆菌的相应序列进行对比，并用ＭＥＧＡ３．１软件邻接法绘制系统发育树，结果表明，ＢＴＧ菌株与Ｂ伽ｉ盯獬４２５的１６ＳｒＤＮＡ基因片段大小分别为１ｂｐ和ｌ４２３琥ｕ一昭沈瑚括和Ｂ∞垅船伽．ｅ獬属于同一分支（图３一Ａ），与Ｂ．玑删昭据邢蠡（ＩＥＢＣ他４００１）同源性为９９％，而ｘ５菌株与鼠ｃ盯ｅ獬构成同一分支（图３一Ｂ），与曰．∞阳琊（ｓ４５）同源性为１００％。菌株Ｂ’ｒＧ和Ｘ５的基因库登录号分别为ＨＭ５８５２８２和ＨＭ５８５２８３。
Ａ
Ｂ
图３
Ｆｉｇ．３１６ＳｒＤＮＡ序列构建芽孢杆菌ＢＴＧ（Ａ）和Ｘ５（Ｂ）系统进化树状图１６ＳｎＩｙｌｏ妒ｎｅ雠ｔｒ∞０ｆｒＤＮＡ妒ｎｅｏｆ及ｍ硼ｈ博叩．ｓｔｌ嘣璐ＢＴＧ（Ａ）粕ｄＸ５（Ｂ）
第４期肖同建，等：不同根际细菌对南方根结线虫抑制效果的研究６３３讨论
物，都具有较强液化明胶的能力。虫生真菌粉质拟青霉（心８ｃ洳，ｎ膨知一肋ｓ懈）以明胶为唯一碳氮源时，发酵产生的蛋白酶能穿透鳞翅目类虫体的表皮¨８｜。本试验表明，在明胶平板上不同菌株水解圈大小在一定程度上可以反映菌株利用胶原蛋白质的能力，也反映了菌株对根结线虫抑制作用的潜力。
本研究筛选出的对根结线虫生长有较强抑制作用的拮抗菌，经鉴定属于芽孢杆菌类细菌。已有研究表明，根际细菌对根结线虫生长的抑制作用有：通过产生杀毒物质直接杀死线虫，或改变根系分泌物与线虫相互作用的方式，或占据营养和空间位点等¨引；Ｈｕａｎｇ等Ⅲ１分离出一株对根结线虫有杀毒作用的芽孢杆菌（曰．聊，耽幻ｃｉ如）；也有研究表明蜡样芽胞杆菌（Ｂ．∞ｒｅ瑚）可以产生非蛋白质类的毒素物质杀死害线虫的外表皮是防止外来微生物对其侵害的主要屏障¨６。。Ｕｅｓｕ百等Ⅲ１筛选出产胶原蛋白酶的微生虫旧川；ｃ啪Ｂ蛋白基因从苏云金芽孢杆菌（Ｂ．琥Ⅱ＾凡ｇ如瑚蠡）转入番茄植物体内也可以抗根结线虫的侵入瞄ｏ；Ｋｈａｎ等…研究报道，根际细菌多黏芽孢杆菌不同浓度的培养过滤液，能使二龄幼虫致死和抑制虫卵的孵化，减少番茄植株的根结数，能够很好地抑制根结线虫对番茄的危害。在本研究中，拮抗菌对二龄幼虫死亡率、虫卵孵化率及番茄根结数量变化的影响表明，菌株ＢＴＧ和ｘ５都表现出了对根结线虫有较强的抑制效果。已有研究表明，与本研究获得的根际细菌ＢＴＧ和Ｘ５亲缘关系最近的苏云金芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌能够产生一种或几种蛋白酶、毒素或其他次生代谢产物旧埘］。菌株ＢＴＧ和）【５对根结线虫生长抑制作用的机制尚需要进一步深入研究。
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Ｐｅｄｏｂｉｏｌｏ西ａ，２００２，４６：５５８—５７２责任编辑：范雪梅
不同根际细菌对南方根结线虫抑制效果的研究
作者：
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年，卷(期)：肖同建， 陈芳， 朱震， 李蕊， 张鹏， 冉炜， 沈其荣， XIAO Tong-jian， CHEN Fang， ZHU Zhen，LI Rui， ZHANG Peng， RAN Wei， SHEN Qi-rong南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏南京,210095南京农业大学学报Journal of Nanjing Agricultural University2011,34(4)
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