黑龙江东方学院
本 科 生 毕 业 论 文（设 计）
牛乳中抗生素残留的检测
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黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）任务书
本表一式三份，学生本人、指导教师、学部各一份。
牛乳中抗生素残留的检测
摘 要
本实验采用国标TTC 法，纸片法和试剂盒法三种微生物方法对哈尔滨市大型超市中不同品牌的13种牛奶进行抗生素检测, 并对三种微生物法进行比较。实验结果证明：快速检测法比TTC 法和微生物纸片法的灵敏度要高，国标TTC 法检测结果不是很准确；纸片法虽然较准确但前序工作所耗时间特别长。
本研究通过三种微生物法的检测结果的比较，为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。
关键词:抗生素；TTC ；纸片法；试剂盒
Test the Antibiotic’s Survival in Milk
Abstract
There are three methods in this experiment .They are GB TTC method, disk method and detection met.The experiment is testing the antibiotic’s survival in milk.The 13 kinds of milk in different brands of large supermarkets,and comparing the three methods in harbin. The result of experimental show that: rapid detection method is more sensitive than GB TTC method and disk method, but GB TTC method moreexact than.Though the disk method is more correctly,its pre-arrange’s time is ionger than others.
In this study, through the comparing in the results of three microbiological methods, it provides a theoretical basis for the supplement to rapid detection of antibiotic survival.
Key words: antibiotics; TTC; disk method; detection met
目 录
摘 要 .................................................................................................................................. i Abstract ................................................................................................................................ ii 第1章 绪 论 ................................................................................................................... 1 1.1 抗生素简介 .................................................................................................................... 1 1.1.1抗生素的概念 .......................................................................................................... 1 1.1.2抗生素的分类 .......................................................................................................... 1 1.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因 .............................................................. 2 1.2.1牛奶中抗生素残留的危害 ...................................................................................... 2 1.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因 .............................................................................. 3 1.3 牛奶中抗生素残留的现状 .......................................................................................... 3 1.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展 .............................................................................. 4 1.4.1 微生物检测法 ......................................................................................................... 4 1.4.2理化检测法 .............................................................................................................. 5 1.4.3快速检测试剂盒 ...................................................................................................... 6 1.5 本实验研究的目的与意义 .......................................................................................... 7 第二章 实验材料和方法 ................................................................................................... 8 2.1 实验材料 ...................................................................................................................... 8 2.1.1材料 .......................................................................................................................... 8 2.1.2 主要仪器和设备 ................................................................................................... 10 2.2 试验方法 .................................................................................................................... 10 2.2.1 原料预处理 ........................................................................................................... 10 2.2.2 TTC法 . ................................................................................................................... 13 2.2.3试剂盒法 ................................................................................................................ 13 2.2.4 纸片法 ................................................................................................................. 13 第三章 结果与讨论 ......................................................................................................... 15 3.1判定方法与结果 ......................................................................................................... 15 3.1.1 TTC法 . ................................................................................................................... 15 3.1.2 试剂盒法 ............................................................................................................... 16
3.1.3纸片法 .................................................................................................................... 17 3.2 结果统计 .................................................................................................................... 18 3.3 方法比较 .................................................................................................................... 18 3.3.1从检测时间 ............................................................................................................ 18 3.3.2从灵敏度上 ............................................................................................................ 18 3.3.3 应用场所 ............................................................................................................... 19 3.3.4判定结果的方便性 ................................................................................................ 19 结 论 ................................................................................................................................. 20 参考文献 ............................................................................................................................. 21 致 谢 ................................................................................................................................. 22
第1章 绪 论
牛奶是最接近“完善”的食品，它含有丰富的动物蛋白质和人体需要的氨基酸、维生素、矿物质、钙质、脂肪、糖类等多种营养成分，所以它不仅是新生儿天然的全营养食品，也是男女老少理想的营养食物。因此，各个国家对牛奶的质量与安全问题十分重视，与此同时，在检测技术上各国都进行大量的研究。
随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视[1]。对此，检测技术也迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量要求，保证人们引用牛奶的卫生和安全。
1.1 抗生素简介
1.1.1抗生素的概念
由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及甚至用化学方法合成或半合成的化合物。 1.1.2抗生素的分类
抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类有以下几种：
（一）β-内酰胺类青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有β-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类、单内酰环类，β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等。 （二）氨基糖甙类包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。
（三）四环素类包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。 （四）氯霉素类包括氯霉素、甲砜霉素等。
（五）大环内脂类临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。
（六）作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。
（七）作用于G 菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平
等。
（八）抗真菌抗生素如灰黄霉素。
（九）抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、放线菌素D 、博莱霉素、阿霉素等。 （十）具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。
1.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因
1.2.1牛奶中抗生素残留的危害 1.2.1.1 产生过敏反应
由于一般的抗生素对热的稳定性高，牛奶加热杀菌无法将其破坏，所以混有抗生素的牛奶加工成奶制品后仍有大量的抗生素残留[2]，如果经常饮用此种牛奶，将反复受到抗生素的刺激而发生致敏。有报道称，一对青霉素高度敏感的病人，在食用含抗生素约 10 IU/mL 的商品奶后，发生了变态反应[3]。 1.2.1.2 产生耐药性菌株
人类经常食用含抗生素的奶制品，某些细菌因长期接触抗生素而产生了耐药性，当机体发病时，因耐药菌株的存在而使治疗效果下降或完全失效，从而危及病人生命。 1.2.1.3 造成人体肠道内的菌群失调
正常情况下，人体内的菌群维持在一个平衡状态，但当长期接触含抗生素残留的牛奶时，此种平衡状态将会遭到破坏，引起胃肠疾病和生理紊乱，如造成维生素缺乏和紫癫性损伤。 1.2.1.4 其他危害
此外牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的原料奶生产酸奶或奶酪等，则残留的抗生素将会抑制细菌的发酵，降低产量和质量，给生产者造成经济损失。
1.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因 1.2.2.1 对泌乳期奶牛的用药治疗
对泌乳期奶牛用药不当或不注意安全时间是造成牛乳中抗生素残留的重要原因，尤其是采用乳房灌注治疗奶牛乳房炎时，更易造成牛乳中抗生素的残留。美国食品和药品管理局（FDA ）调查结果表明，用药不当是造成牛乳中抗生素残留的主要原因[4]。
1.2.2.2抗生素作为奶牛饲料添加剂使用
在饲料中添加抗生素，可有效抑制或杀灭畜体内的有害微生物，维持畜体胃肠道微生物的平衡，从而促进动物的健康，提高其生产性能但是，奶牛如果长期食用含抗生素的饲料，很容易造成牛奶中抗生素残留，这也是造成牛奶中抗生素残留问题的一个重要原因。
1.2.2.3受到抗生素污染的挤奶工具和贮奶用具
某些奶牛场由于操作不规范，在尚未彻底清洗和消毒患乳房炎的奶牛使用过的挤奶工具和贮奶设备情况下，用于其它健康牛只，造成抗生素残留问题。 1.2.2.4 在牛奶中加入抗生素防止牛奶腐败
一些不法交奶户在高温季节为了防止牛奶酸败，在牛奶中掺杂各种抗生素通过抑制细菌生长以达到防止牛奶酸败，保持牛奶品质的目的，这也是牛奶中抗生素残留的一个重要原因。
1.3 牛奶中抗生素残留的现状
牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视[5]。联合国粮农组织（FAO ）和世界卫生健康组织（WHO ）早在 1969 年就提出，应对各种动物性食品中的抗生素残留规定允许标准，并建议在奶牛接受抗生素治疗停药后至少 3d （最好 5～7d ）的牛奶不能作为食用奶的原料。欧美国家多年前即已明文禁止抗生素残留超量的牛奶上市（对青霉素类药物的限量为 4～10μg/kg）。我国虽然也颁布了相关管理条例，但是由于各种原因牛奶中抗生素残留问题依然十分严重。丁洁等在2003 年对南京市牛奶中抗生素残留进行了调查[6]，发现消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为13.3% 、37.8% 、34.4% 、3.2% ；广州市卫生防疫站对广州市牛奶中抗生素残留进行监测，结果如下：消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为21% 、39% 、44% 、60% 。可见国内市场中牛奶抗生素超标现象十分严重，应引起社会重视[7]。
1.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展
1.4.1 微生物检测法
微生物检测法测定原理是根据抗生素对微生物的生理代谢作用的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素的残留[8]，如纸片法（PD 法），TTC 法，拭子法（STOP ）
等。微生物法具有费用低，操作简便，可靠性高等特点。但该方法必须经过几个小时才能观察到结果，测定的结果与试验菌株的敏感性，琼脂平板中的试验菌株数，培养基及其成分的pH 值有关，且通过肉眼判断显色状态，容易产生误差。目前常用的两种方法是纸片法（PD 法）和TTC 法。 1.4.1.1纸片法
常用的纸片法包括枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法[9]，主要用于检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素。枯草杆菌纸片法只适用于β-内酰胺类抗生素的检测，检测限为0.01IU/mL，而嗜热脂肪杆菌纸片法不仅适用于β-内酰胺类抗生素的检测，他还可检测到奶样中其它抗生素的存在，检测限为0.008IU/mL。 1.4.1.2 TTC 法
TTC 法，即氯化三苯四氮唑试验，它是目前我国食品卫生标准中规定的检测牛奶中抗生素残留的检测方法[10]。此方法为向检样中加入嗜热乳酸链球菌和 TTC 试剂，通过观察显色状态的变化判定检样中有无抗生素存在。乳样中有抗生素存在，则在向检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂 TTC 不还原，所以不显色。相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖，TTC 被还原而显红色。也就是说当检样呈乳的原色时为阳性，微红色是为可疑，桃红色或红色时为阴性。目前 TTC 法检测的各种抗生素灵敏度如下：青霉素为0.004单位、链霉素0.5单位、庆大霉素0.4单位、卡那霉素5单位。 1.4.1.3 DelvotestSP（ 戴尔沃检测法）
DelvotestSP 检测法是由荷兰 Gist-brocades BV 公司开发的。其与先前的 DelvotestSP 相似，但用时更短，只需培养 2h ，对青霉素的检测灵敏度提高到 0.003-0.004IU/mL。它可检测的抗生素种类更多，包括青霉素 -G 、氨苄青霉素、头孢噻林、新霉素、土霉素、阿莫西林、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、四环素、金霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、泰乐菌素和甲氧苄氨嘧啶等。D.Scannella ，P. 等通过实验比较 DelvotestP 和DelvoX-Press 两种检测方法得出以下结论：DelvoX-Press 能准确测定原料奶中的 β- 内酰胺类抗生素，可应用于农场外散装原料奶的检测[11]。由于使用快速方便，价格更低，因此适合奶牛场的抗生素快速检测。
1.4.1.4其它方法
Brilliant Black Reduction Test(亮黑裉色试验) 是另一种重要的检测方法，包括德国的 AiM-Aanlytikin Mitch Production-und Vertiebs GmbH.BRIBRT Aim 和荷兰的Gist Brocades 等。它所用的菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌。阴性样品呈黄色，否则呈蓝色。目前仍有许多关于新技术和方法的报道，如 Gaudin 发表了生物传感器方法测定 β- 内酰胺类抗生素残留方法。 1.4.2理化检测法
理化检测方法的原理是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量[12]。它包括波谱法、色谱法及其联用技术，如 HPLC 、GC 、薄层色谱法（ TLC ）、毛细管电泳（CE ）等。理化检测法具有灵敏度高，可进行准确定性分析（ 给出被测组分的结构信息）和定量分析能力的优点，Takeba 等人已经成功地使用 HPLC 同时检测出牛奶中三氯苯达唑及其代谢产物亚砜和砜；Pollmeier 更是在十亿分之的水平上检测出牛奶中的阿维菌素类似物乙酰氨基阿维菌素。但理化检测程序复杂，且费用较昂贵。最常用的方法为高效液相色谱法和联用技术。 1.4.2.1 高效液相色谱法
HPLC 是在经典的液相色谱法基础上发展起来的。通过引入气相色谱的理论和技术，发展了高分离效能的色谱柱和高灵敏感性的检测器，特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析，因此，高效液相色谱法成为目前广泛应用的一种抗生素残留检测手段。 1.4.2.2 HPLC 使用的检测器
目前在残留分析中使用的主要HPLC 检测器为紫外可见（UVD ）、荧光（FLD ）和电化学 (Echo）检测器。UVD 是应用最早和最广泛的 HPLC 检测器。目前绝大多数 HPLC 系统都配备有该种检测器。其灵敏度高，选择性较好，能满足残留分析的一般要求。UVD 对环境温度，流动相组成和流速变化不敏感，能适应等度和梯度洗脱[13]，对强紫外吸收的物质的检测限可以达到 1ng 以下。在许多常规分析中，HPLC/PDA 是一种简便的定性分析方法。 1.4.2.3 联用技术
各种分析技术联用是现代兽药残留分析的发展趋势。它一般集分离、定量和定性于一体，特别适用于确证性分析。张素霞等报道了用 M SPD-HPLC-UV 分析法检测
牛奶中四环素类药物残留。样品平均回收率为 78.7% ～90.2% ，变异系数在 2.4% ～18.1% 之间，方法检测限为 0.02～0.05μg/mL；贾薇等建立了一种用 C18 小柱进行固相萃取，液相色谱 - 质谱联用仪检测牛奶中 4 种四环素类的方法，每毫升牛奶中含四环素、土霉素及美他环素为 0.05μg，金霉素0.1μg时可以被定量检出；而 Van Bruiynsvoort 则成功运用色谱联用技术测定了牛奶中的链霉素和二双氢链霉素。常见的联用技术包括：GC-M S、LC-M S、SFC-M S、CZE-M S 等。目前GC-M S 应用较多，而 LC-M S 是除 GC-M S 之外，又一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。
1.4.3快速检测试剂盒 1.4.3.1微生物法
荷兰Gist-brocades BV公司开发了DelvotestP ，DelvotestSP ，Delvotest Cow Test，DelvotestMCS 检测系列[14]。DelvotestP 成型于20世纪70年代，主要用于检测内酰胺类抗生素，装在小型安碚瓶或者微孔板微孔中的琼脂里，含有用微胶囊包裹的标志微生物嗜热硬脂酸芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的芽孢和pH 指示剂(溴甲酚紫) ，同时包装内附有一瓶营养药片，检验时将营养药片与乳样同时放在培养基上，在64e 温度下培养3h ，培养基颜色由紫变黄表明抗生素残留阴性，颜色不变表示阳性。琼脂装在小型安碚瓶里的格式适用于小规模和单个试验，微孔板格式一次可以同时检测96个乳样，适用于大批量乳样检验。DelvotestP 已经在全世界通用，可以检测到0.05IU/mL浓度的青霉素G 。DelvotestSP 则可以检测包含B-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素(如磺胺类、泰乐霉素、红霉素、链霉素、庆大霉素、三甲氧卞二氨嘧啶等) 。DelvotestSP 的用法基本与DelvotestP 相同，只是培养时间缩短为2h ，对青霉素G 的敏感度可以提高到0.03IU/mL~0.04IU/mL。Delvotest Cow Test与DelvotestP 小型安碚瓶格式除外装不同外，内容物和用法基本相同，还配有加热池，更适合牛奶场使用。Delvotest MCS是DelvotestSP 的微孔板格式，但营养试剂已直接加入琼脂内，使用时无需再添加营养药片，操作更方便，但保质期短，适合于大型检测中心使用。 1.4.3.2免疫法
Snap 法是美国IDEXX Laboratories Inc 公司采用酶联免疫吸附(ELISA)原理，将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法，其敏感性和特异性较好。在需要检测其他种类的抗生素时，可以选用对应的试剂盒进行检测。在检测结
果方面，不仅可以知道结果的阴性阳性，而且也可了解所检测的结果是哪一类抗生素。Snap 快速检测法耗时9min ，结果重现性好，操作简便，但实验成本较高。 1.4.3.3 基于受体分析法
比利时UCB Byproducts公司开发的Beta-STAR 检测法是将特定的B-内酰胺受体蛋白固定在试纸上，用胶体金有色微粒作为标记物，5min 内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。美国Charm Science 公司Charm MRL 检测法与Beta-STAR 检测法形式十分相似，在8min 内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。比利时UCB Byproducts 公司开发的Penzym 检测法有两种形式:Penzy和PenzymS ，它们的区别是培养时间和灵敏度不同，此方法适用于检测B-内酰胺类和头孢菌素类抗生素。
1.5 本实验研究的目的与意义
牛奶是营养最全面的营养品 。但饮用含有抗生素残留的牛奶可引起细菌耐药性， 导致人体过敏反应等症状。 经常饮用抗生素超标的牛奶还会破坏人体道菌群平衡。抗生素的影响使酸奶 、奶酪等一些高质量的牛乳产品无法加工生产，造成大量的原料奶浪费，致使企业遭受很大的经济损失。
牛奶中抗生素残留问题日益受到社会各界的重视。抗生素检测的方法、 检测技术也随之迅速发展，只有简便 、快速 、准确 、灵敏性高的检测方法才能满足日趋严格的检测要求。 保障人们饮用牛奶的卫生和安全。 抗生素的检测方法很多， 主要可以分为微生物测定法、理化测定法和免疫学测定法[15] 等。本实验通过国标TTC 法和试剂盒法、纸片法检测结果的比较为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1材料 2.1.1.1采样
从哈市食品商场随即采取六个主要品牌不同品种的袋装消毒纯牛奶及其相关品牌的花色奶作为检样，将采集的样品编号，送实验室检测，乳样共计13份，见表2-1。
表2-1 原材料表
品种 纯牛奶
编号 1 2 3 4 5 6
规格（ml ）
220 220 220 220 220 220 280 250 220 280 240 250 220
来源 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售 市售
花色奶
7 8 9 10 11 12 13
对照试验样品的采样，见表2-2。
表2-2 对照样品表
对照样品 脱脂乳+青霉素
编号 14
来源
脱脂乳: 东北农大食品实验室提供 青霉素: 天林药业有限公司提供
灭菌生理盐水+青霉
素 无抗脱脂乳 灭菌生理盐水
2.1.1.2菌种
15
NaCL: 天林药业有限公司提供 青霉素: 天林药业有限公司提供
16 17
市售 市售
嗜热乳酸链球菌，由东北农业大学乳品研究中心提供； 枯草芽孢杆菌，由黑龙江东方学院微生物实验室提供。 2.1.1.3主要药品与培养基 （1）脱脂乳：经113℃、20min 灭菌 （2）牛肉膏蛋白胨培养基： a 牛肉膏蛋白胨培养基的配方：
牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCL 5.0g 水 1000ml pH 7.0～7.2
b 溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，Nacl ，琼脂，1mol ／L NaOH，1mol ／LHCL 。 c 仪器或其他用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压灭菌锅，PH 试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 （3）试剂
TTC 指试剂：4% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC ）批号830222。
TTC 水溶液：称取1gTTC ，溶于5ml 灭菌蒸馏水中，装入褐色瓶内与7℃冰箱保存，临用时用灭菌蒸馏水以1:5稀释。如遇溶液变为绿色或淡褐色，则不能再用。
2.1.2 主要仪器和设备
表2-3 主要实验仪器与设备
仪器与设备
Hws24型电热恒温水浴锅 DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 LRH-50生化培养箱 京制00000249号电子天平 科拓抗生素检测试剂盒 容声冰箱
JJ200型精密电子天平 高压灭菌锅
生产厂家
上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司 上海一恒科技有限公司
北京赛多利斯仪器系统有限公司 北京科拓恒通生物技术开发邮箱公司 广东科龙电器股份有限公司
美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂 上海一恒科技有限公司
检测试剂盒由反应管、营养药片、取样注射器、取样吸头、镊子和使用说明书等组成。 其中：
检测反应管 50×2 营养药片 100 片 取样注射器 1支 取样吸头 100支 镊子 1支 使用说明书 1份
2.2 试验方法
2.2.1 原料预处理
TTC 法: 依据GB4789 27-94方法检测抗生素残留。阴性对照管为无抗生素10%还原脱脂乳粉溶液，阳性对照管为10%还原脱脂乳粉加青霉素钾盐[16]。
纸片法: 青霉素标准液，准确称取青霉素G 钾标准品20mg ，用磷酸盐缓冲液溶解，制备为1 000g/mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存。
试剂盒法：试剂盒中的反应管和营养药片，保存于0~15℃，避光、干燥阴凉处，防止凝结成块或冻结。
2.2.2 TTC法
按照国家标准中规定的TTC 实验法并参考有关文献进行。 2.2.2.1 灭菌脱脂乳培养基制备
取12.00g 脱脂乳粉配制成100ml 乳液于水浴锅中煮沸30min 后，置4℃冰箱过夜，然后弃去上层乳脂，将脱脂乳分装大试管，10磅20min 灭菌备用。 2.2.2.2 菌液制备
将冻干保存的嗜热性乳酸链球菌接种于灭菌脱脂乳培养基中，36±1℃培养15h 。再转接2~3次，以活化菌种脱脂乳培养基，经36±1℃培养15h 后，以灭菌脱脂乳1∶1稀释待用。 2.2.2.3检验方法
（1）取待检乳液9ml ，置灭菌试管中，80℃水浴加热5 min。
（2）冷却至37℃以下，加制备的菌液1ml ，36±1℃水浴培养2h 后，向试管内加4%TTC试剂0.3ml ，36±1℃水浴中培养30min 后取出，观察结果。
（3）结果观察 乳中有抗生素存在时，加入指示剂TTC 后牛乳不显色，即抗生素阳性；相反，如果没有抗生素存在，则加入TTC 后显红色，即抗生素阴性。抗生素阳性者，在于水浴锅中培养30min 第二次观察，记录结果。（见表2-4）
表 2-4 显色状态判断标准（GB4789）
显色状态 未显色者 微红色者 桃红色～红色
判断 阳性 可疑 阴性
（4）每份检样作两份，同时做阴性和阳性对照各一份，阳性对照用无抗生素乳8ml 加1ml 青霉素溶液（0.16IU ／ml ）及菌液1ml 和4%TTC试剂0.3ml 。阴性对照用无抗生素乳9ml 加菌液1ml 和4%TTC试剂0.3ml ，其他同于检样反应。