中国修复重建外科杂志2008年12月第22卷第12期
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魏在荣 王玉明 罗丹 游小军 王达利 孙广峰 王波
【摘 要】 目的 探讨低剂量环磷酰胺（cyclophosphamide，CY）对特重度烧伤大鼠早期肺实质细胞凋亡的影响及可能机制。 方法 清洁级雄性SD大鼠90只，随机分为3组：空白组（n=10）、实验组（n=40）和单纯烧伤组（n=40）。实验组和单纯烧伤组制备30%体表面积Ⅲ度烧伤动物模型，实验组于造模后立即腹腔注射CY（2 mg/kg），单纯烧伤组和空白组不作任何处理。造模后3、6、12和24 h取肺组织，行HE染色观察，并采用TUNEL法观察肺实质细胞凋亡变化。 结果 组织学观察示空白组肺泡结构清晰，肺泡腔及支气管腔未见明显炎性细胞及渗出物，可见少许RBC；单纯烧伤组见肺泡隔明显增宽，肺泡壁破坏，肺间质水肿，肺萎陷等病理改变，且随时间延长肺病理损害逐渐加重；实验组相应时间点上述损害均好于单纯烧伤组。单纯烧伤组肺实质细胞凋亡比例于建模后3 h持续增高，12 h达峰值，与空白组比较差异有统计学意义（P
EFFECT OF LOW-DOSE CYCLOPHOSPHAMIDE ON THE APOPTOSIS OF LUNG PARENCHYMA CELLS IN THE EARLY SEVERE BURN STAGE IN RATS/WEI Zairong, WANG Yuming, LUO Dan, YOU Xiaojun, WANG Dali, SUN Guangfeng, WANG Bo. Department of Burn and Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou, 563003, P.R.China. Corresponding author: WANG Yuming, E-mail: [email protected]
Objective To study the effect of low-dose cyclophosphamide (CY) on apoptosis of lung parenchyma 【Abstract】
cells in the early severe burn stage in rats. Methods Ninety clean SD male rats were randomly divided into 3 groups: the normal group (n=10), the experimental group (n=40) and the burn group (n=40). The model of degree III with 30% burn area was made in the experimental group and the burn group. CY (2 mg/kg) was injected into the abdominal cavity right after burn in the experimental group. No treatment was done in the normal group and burn group. Lung tissues were obtained at 3, 6, 12 and 24 hours, respectively, after burn, and were observed by HE staining. Apoptosis of lung parenchyma cells was observed by TUNEL. Results Lung tissues were observed under the opticalmicroscopy in the normal group: the pulmonary structure was clear, and there were no inflammatory cells and exudation in the alveolar space and bronchial lumen. Besides, a few RBCs were seen. Pathological changes of lung tissues were observed under the opticalmicroscopy in the burn group: alveolar septum was obviously widened; alveolar wall was destroyed; interstitial edema and atelectasis occurred; and pathological lesion was gradually aggravated as time passed by. The pathological lesion of lung tissues mentioned above in the experimental group was better than those in the burn group. Compared with the normal group, the apoptosis ratio of lung parenchyma cells continuously increased in the burn group from the 3 hour after burn, and reached the peak at 12 hours. There were significant differences between the two groups (P
Foundation items: Science and Technology Foundation of Guizhou Province (2005-3015); Foundation of Health Department of Guizhou Province (2006D-236）
基金项目：贵州省科技基金资助项目（2005-3015）；贵州省卫生厅基金资助项目（2006D-236）563003）作者单位：遵义医学院附属医院烧伤整形科（贵州遵义，
E-mail: [email protected]通讯作者：王玉明，教授，硕士导师，研究方向：烧伤脓毒症，
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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2008, Vol. 22, No.12
环磷酰胺（cyclophosphamide，CY）作为抗炎药正常治疗剂量为20～40 mg/kg。在正常治疗剂量下，其毒副作用大，临床应用受到极大限制，Ponzinibbio等[1]认为使用2.5～5.0 mg/kg低剂量CY无毒副作用。我们前期实验证实低剂量CY能降低脓毒症大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-8水平，减轻炎性反应，延长大鼠的生存时间[2-4]。本次实验我们采用低剂量CY干预烧伤脓毒症急性肺损伤大鼠模型，观察低剂量CY对特重度烧伤早期肺实质细胞凋亡的影响，探讨其可能机制。1 材料与方法1.1 主要试剂
TUNEL试剂盒（晶美生物工程有限公司）；CY（山西普德药业有限公司）；戊巴比妥钠、3%凝固汽油由第三军医大学烧伤研究所提供。1.2 实验动物分组及模型制备
清洁级雄性SD大鼠90只，体重160～200 g，由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供。随机分为3组：空白组（n=10）、实验组（n=40）和单纯烧伤组n=40）。
按文献[5]方法制备动物烧伤模型。取实验组和单纯烧伤组大鼠，3%凝固汽油涂抹于脱毛皮肤后点燃20 s，造成30%体表面积Ⅲ度烧伤，立即腹腔注射乳酸林格液（50 mL/kg）抗休克。实验组模型制备后腹腔注射CY（2 mg/kg），单纯烧伤组、空白组不作任何处理，大鼠自由饮食。1.3 检测指标1.3.1
组织学观察 实验组和单纯烧伤组在建模成功
后3、6、12和24 h，放血处死动物，生理盐水灌洗支气管后取出肺部标本，立即置入— 80℃冰箱保存；空白组动物待以上两组标本留取完成后同上法取材。所有标本固定，切片，片厚3～4 μm，常规行HE和TUNEL染色。
1.3.2 凋亡细胞计数 TUNEL染色切片组织学观察后，于高倍镜下随机取5 个以上视野，每个视野计数50～100 个细胞，计算凋亡细胞所占比例=凋亡细胞数/细胞总数。1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，P值
2.1 组织学观察
2.1.1 HE染色 空白组大鼠肺泡结构清晰，肺泡腔及
支气管腔未见明显炎性细胞及渗出物，可见少许RBC（图1 a）。建模后3 h，单纯烧伤组肺泡壁无明显病理损害，肺间质无明显水肿，肺泡腔、支气管腔渗出；与实验组比较，未见明显异常。6 h时，单纯烧伤组肺泡隔增宽，肺泡壁有破坏，肺间质水肿，肺泡腔及支气管腔可见RBC、炎性细胞、脱落上皮细胞、肺萎陷等病理改变；实验组上述损害较单纯烧伤组明显减轻。12 h时，单纯烧伤组病理改变与6 h时相似，但明显较严重（图1 b）；实验组上述损害均好于单纯烧伤组（图1 c）。两组24 h时肺组织病理情况与12 h相似。
2.1.2 TUNEL染色 TUNEL 染色阳性标志为细胞核呈棕黄色。空白组可见部分凋亡细胞，凋亡阳性细胞主要为支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞（图2 a）。各时间点单纯烧伤组可见大量凋亡细胞，凋亡阳性细胞主要为支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞，其中12 h时凋亡细胞数达最高峰（图2 b）。各时间点实验组可见凋亡细胞主要为支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞，随着时间推移凋亡逐渐减少（图2 c）。2.2 凋亡细胞计数
单纯烧伤组肺实质细胞凋亡比例从建模后3 h持续增高，12 h达峰值，与空白组（0.14 ± 0.01）比较差异有统计学意义（P
表1 大鼠术后肺实质细胞凋亡比例（n=10 ± s）Tab.1 The apoptosis ratio of lung parenchyma cells of rats （n=10）
组别
时间（h）Group
Time（h）
3
61224单纯烧伤组
Burn group0.23 ± 0.01
0.25 ± 0.010.58 ± 0.020.55 ± 0.03实验组
Experimental 0.22 ± 0.01
0.14 ± 0.02
0.12 ± 0.01*
0.04 ± 0.01*
group
*与单纯烧伤组比较 P值
Compared with burn group, P
3
讨论
烧伤后肺部并发症发病率居内脏并发症首位。早
期主要为急性肺损伤（acute lung injury，ALI），后期主要为肺部感染。目前认为ALI是机体过度炎性反应导致肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损破坏的
（
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图1 建模后12 h HE染色观察（× 400）
空白组
单纯烧伤组
实验组
observation by TUNEL staining at 12 hours (× 400)
单纯烧伤组
实验组 图2 建模后12 h TUNEL染色观察（× 400）
空白组
Fig.1 Histological observation by HE staining at 12 hours (× 400)
Normal group
Normal group
Burn group
Experimental group Fig.2 Histological
Burn group
Experimental
group
结果，相关细胞（如肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞、多形核WBC和肺巨噬细胞）的凋亡可发生于不同阶段，且在疾病进程中起重要作用[6-9]，特别是肺泡上皮的主要组成细胞——肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡ epithelial cells，AT-Ⅱ）在ALI中有明显的凋亡现象发生[10]。在发生ALI/急性呼吸窘迫综合征时，肺上皮/ 内皮细胞大量凋亡，使肺表面活性物质分泌进一步减少，肺毛细血管通透性增加，进而大量肺泡塌陷、肺间质/ 肺泡水肿，气血交换障碍，导致顽固性低氧血症[11]。本实验结果提示特重度烧伤后大鼠肺实质细胞凋亡明显增加，且随着时间推移逐渐增加，HE染色观察可见肺泡隔明显增宽，肺泡壁破坏，肺间质水肿，肺萎陷等病理改变，提示特重度烧伤后肺脏早期即损伤，且随着时间延长损伤进一步加重，与临床表现一致。
CY在体外无活性，进入体内后依赖于肝脏细胞微粒体酶系统，在细胞色素P-450的作用下，先氧化成为4-羟环磷酰胺，继而开环，再产生醛磷酰胺和丙烯醛，前者与DNA产生烷化作用而使其变性、失活或断裂，导致细胞死亡[12]。Kehrer等[13]报道CY在低剂量使用时抑制细胞增殖而不导致细胞坏死，并且可增加细胞凋亡，同时也证实其能抑制转录因子AP-1和NF-κB活化。大剂量CY主要用于肿瘤化疗，而低剂量CY在抗炎和免疫调节方面的作用也得到了大量研究证实[14-15]。Ponzinibbio等[1]和Waymack等[16]研究表明，低剂量CY无明显细胞毒副作用，能明显延长烧伤和感染（致死性病毒诱导）豚鼠的生存时间。TNF-α、
IL-6 等细胞因子上调是烧伤后早期肺组织损害的重要原因之一。王达利等[2]通过对烧伤大鼠的研究证实低剂量CY能减少烧伤大鼠血液中TNF-α含量，明显延长烧伤大鼠生存时间。严重烧伤后肺组织NF-κB活化，从而启动细胞黏附因子和趋化因子的合成和释放，导致中性粒细胞在肺组织聚集，引起肺血管组织细胞损伤[17-19]。有研究表明，低剂量CY与地塞米松一样具有明显的抗炎作用，能降低肺损伤大鼠血清IL-1β和
IL-8水平，明显下调NF-κB P65蛋白的表达，减轻肺组织损害[3-4，20]。地塞米松能抑制急性肺损伤肺上皮细胞凋亡，减轻肺部炎性应答，具有调节肺实质细胞凋亡和增殖平衡的作用[21-22]。TNF-α能通过抑制AT-Ⅱ增殖和促进其凋亡，损伤肺泡上皮细胞，导致肺损伤[23]。ALI 发生时，AT-Ⅱ损伤和TNF-α等抑制作用使肺表面活性物质相关蛋白A合成减少，使肺损伤进一步加重[24]。使用低剂量CY后，可减少特重度烧伤大鼠体内TNF-α含量，进而抑制AT-Ⅱ凋亡，减轻肺损伤，保护肺功能。我们观察到实验组造模后3 h肺实质细胞凋亡比例与单纯烧伤组相似，6、12 h时明显低于单纯烧伤组，与空白组相似，且HE染色观察发现肺脏损害明显轻于单纯烧伤组。结果提示特重度烧伤大鼠注射低剂量CY后，减少了TNF-α等细胞因子分泌，抑制肺脏细胞凋亡，减轻了肺损伤。
综上述，细胞凋亡在急性肺损伤中起重要作用，低剂量CY能抑制肺实质细胞凋亡，减轻肺损伤，但影响肺实质细胞凋亡的确切机制有待进一步研究。
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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2008, Vol. 22, No.12
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（收稿：2008-08-27
修回：2008-10-06）
（本文编辑：
苟莉）
•读者•作者•编者•
我刊拟定2009年推出以下重点专题栏目：①骨支架修复重建 ③关节功能重建
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②干细胞与组织工程
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2008-10-30