农杆菌注射烟草转化

农杆菌注射烟草实验步骤

农杆菌转化

1. 取1µl质粒加入50µl刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB培养液，1.5ml灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。★感受态易失效，准备工作须充分

2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal至1.6-1.7）。

3. 电击完立即加入1mlLB培养基，混匀，并吸至新的离心管中。

4. 28℃，摇2h（过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。

5. 涂板，（使用kan+rif双抗板）28℃培养36h。

6. 可做菌落PCR检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。

接菌注射

1. 挑菌转接3ml

双抗培养基，27℃摇菌过夜。★玻璃试管摇菌效果要好些

2. 取20µl菌液到20 mlLB培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS +500µlkana/L）摇菌过夜至OD值为1.0-1.5。●不加Rif ★准备两份，最后调OD值会用到。

3. 3560r/min ,10min 弃上清。

4. 配缓冲液MMA（H2O+MES 10ml +MgCl2 10ml +AS 1ml）,现配现用。用等量缓冲液重悬菌液。一份等量，一份少量

5. 调菌液OD值至1.0，室温放置1h。将需要混合的菌液等体积混合，可注射。

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