用于中药鉴定的指纹图谱技术

Ｖｏｌ．１７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２００７年增刊检验检疫科学ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮＡＮＤＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥＳＣＩＥＮＣＥ

□科普园地□

用于中药鉴定的指纹图谱技术

王羚鸿１，２

邹明强２

俞腾飞１

（１．内蒙古医学院药学院，呼和浩特，０１００５９；

）２．中国检验检疫科学研究院，北京，１０００２５

摘要：本文从波谱、色谱及生物学诊断技术等方面对中药鉴定的指纹图谱技术进行了介绍。

关键词：中药鉴定；指纹图谱；综述中图分类号：Ｒ２８２．５

中药成分复杂，其疗效往往不是靠某一单一成分，而是许多成分的有机组合，因此，由单一成分作为质量控制指标已越来越不能适应中药质量控制的要求。而中药指纹图谱可反映中药的整体化学特征及其多组分、多作用靶点的特点。因此它的产生是保证中成药功效、实现中药现代化并走向世界的必须，同时也是牵动行业全面进步的关键技术［１￣３］。

中药指纹图谱是指某种（或某产地）

中药材或中

成药经适当的处理后，采用一定的分析手段得到的能够标志该中药材或中成药特征的谱图。这种图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段

［４］

性”是对照品与待测品间图谱的相似性，而不完全相同［５］。其作用主要是：通过指纹图谱的特征性，对中药材及成药进行基源鉴定和品质评价，追踪制剂中某些化学成分的变化，控制药品质量［６］。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中成药及天然药材质量的最有效手段。

针对中药指纹图谱的研究所涉及的方法种类繁多，总体说来可以分为两大类，见８２页图１。一类是采用色谱方法分离特征成分，采用波谱方法鉴定化合物的结构，提高指纹图谱的特征性及可信度

［７，８］

。另一

。其基本属性是类技术为基于聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和印渍技术的脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）指纹。其中基于ＤＮＡ分子标记技术的指纹图谱包括对特异性位点的检测以及非特

“整体性”和“模糊性”。“整体性”是强调完整地比较色谱的特征“面貌”，而不是将其“肢解”。“模糊

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中药指纹图谱

取丰富的结构信息。而且由于ＮＭＲ分析是非破坏性的，一体化的毛细管－核磁共振－质谱（ＣＥ／ＮＭＲ／ＭＳ）多维联

ＤＮＡ指纹图谱

化学指纹图谱

用技术可成为结构分析中最有前景的手段之一［１３］。

１．４质谱法（ＭＳ）［１４］

波谱技术指

纹图谱

色谱技术指纹图谱图１

ＰＣＲ技术指纹图谱分子印渍技术指纹图谱

将中药提取液置于质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的ＥＩ－ＭＳ谱图。不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子、离子峰及进一步的裂解碎片峰也不一样，故得指纹图谱。

中药指纹图谱方法种类

［９］

异性位点的检测，它可以提供待测物的遗传信息。

下面就目前常用的中药指纹图谱技术进行介绍。

２色谱技术

）２．１薄层色谱法（ＴＣＬ

１波谱技术

）１．１紫外光谱法（ＵＶ

由于不同中药所含成分的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度也有差异，这一特性给ＵＶ在中药指纹图谱分析中的应用提供了前提和条件。

ＴＣＬ操作简单，适用范围广，检测快速，结果可靠，具有分离、鉴定双重功能，而且重现性好，是中药分析的常用手段［１５］。它既可以对已知成分定性、定量，也可对未知成分或复杂成分进行特征性鉴别，若配合扫描技术、数码成像和数据处理，可瞬间形成轮廓谱，并给出各峰的积分值，加大了信息量。ＴＣＬ在中药材指纹图谱中应用广泛，它是利用固定波长对薄层展开的各斑点做薄层扫描图谱，显示的谱图可以全面地反映中药材各成分的特征性和专属性，从而提高了综合分析能力［１６］。其缺点是影响其测定结果的因素较多，如薄层板的质量，展开湿度、温度、点样与显色技术及显色灵敏度等。但对中药，ＴＣＬ仍是应用率最高的质量评价方法之一。）２．２气相色谱法（ＧＣ

ＵＶ指纹图谱测量简便，数据重现性好，谱图简洁，便于分析与利用，对于含有紫外吸收区的中药材的鉴定与分析具有一定的作用。）１．２红外光谱法（ＩＲ

ＩＲ专属性强，重复性好，但传统的ＩＲ是对纯物质而言。中药提取液是混合物，其红外光谱是混合物中各组分红外光谱的叠加，光谱的吸收峰强度与峰形是相同或不同的官能团互相作用的结果。中药在化学成分上的差别，必定在其红外光谱上有所反映［１０］。在中药ＩＲ指纹图谱中，不用将混合物的红外光谱各主要吸收峰归属，只要在４０００～４００ｃｍ－１范围内比较光谱的差异即可［１１］。这种差异可以表现在３个方面：某一波数处鉴别的双方只有一方面的差异；

（１）在（２）

在

ＧＣ具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快等优点，可用于中药材挥发性成分的测定，也可经衍生化反应后用于分析中药的其他成分［１７］。直接蒸发ＧＣ的样品不需进行前处理，可直接进行分析；裂解ＧＣ使样品裂解为碎片，对于成分复杂的中药尤为适用。

气相色谱法在联用技术方面应用十分广泛，如气）相色谱／傅里叶变换红外（ＧＣ／ＦＴＩＲ

联用，在没有对

照品而需鉴定未知物时，将图谱与标准图谱库中气相、红外图谱逐一核对或进行图谱分析，可获得特征官能团和色谱图数据信息［１８］。还有气相色谱与质谱联用（ＧＣ／ＭＳ），经气相分离的成分直接进入质谱仪进行测定，适用于多组分混合物中未知组分的定性与定量分析。

）２．３高效液相色谱法（ＨＰＬＣ

某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状与强度都有明显的差异；（３）“指纹区”面貌不同。

１．３核磁共振法（ＮＭＲ）

利用ＮＭＲ光谱图上吸收峰的位置、强度和精细结构研究化合物的分子结构。１Ｈ－ＮＭＲ图谱不仅有单一性、全面性、定量性、易辨性，而且有高度重现性和特征性的优点［１２］。通过选择适当的提取分离程序，对中药进行提取，得其特征总提物，代表了天然药物中各活性物质的整体化学组成。其Ｈ－ＮＭＲ图谱与植

１

物品种之间存在着严格的对应关系，非常适用于中药的指纹图谱和化学分类研究。

在联用技术方面，ＮＭＲ也取得了不少的进展，如：高效液相－核磁共振（ＰＬＣ／ＮＭＲ）

联用技术是同

时进行未知混合物的分离和结构鉴定的手段之一，可以直接确认混合物中各化学成分的结构。毛细管－核磁共振（ＣＥ／ＮＭＲ）

联用技术可快捷有效地分离并获

ＨＰＬＣ具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等优点，满足专属性、重现性和可操作性的要求。目前已成为中药质量控制的首选方法，适合于中药复杂成分的分离、分析，在中药指纹图谱中应用十分广泛［１９，２０］。建立中药ＨＰＬＣ指纹图谱的目的是采用ＨＰＬＣ

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指纹图谱的模式，将中药内在化学物质的特征转化为常规的色谱数据信息，通过对中药材样品特征性的识别，全面、整体、特异性地表征中药材的化学品质，用于中药材的鉴别［２１］。

同样，联用技术的发展对ＨＰＬＣ在指纹图谱中的应用提供了强有力的支持。ＨＰＬＣ／ＭＳ联用可以给出分析物的质谱图，提供分析物的结构信息，对鉴别非常有用；ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ能将一级质谱中飞出的离子，选择碰撞打碎成碎片离子，由二级质谱选择测定，增加了分离能力，并提供了更多的结构信息，检测灵敏度大大提高［２２］。

）２．４超临界流体色谱法（ＳＦＣ

）作为流动相的ＳＦＣ是用超临界流体（常用ＣＯ２

新型色谱。超临界流体的黏度与密度介于流体与气体之间，同时具有和液体相似的溶剂化能力，因此ＳＦＣ兼有气相和液相的优点［２３，２４］，可在较低温度下分离热不稳定性和不挥发性化合物，扩大了样品分析范围。）２．５高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ

就使得人们能够以此为基础进行多态性分析。那些差异可以通过ＰＣＲ技术反映出来，并被用于建立指纹图谱［９］。

３．３简单重复序列间标记技术（ＩＳＳＲ）

在近些年，研究人员逐步开始关注简单重复序列、数目可变的顺向重复序列、简单重复序列长度多态性、短串连重复序列等微卫星结构。这类结构都是存在于所有生物体内的代表性结构。这些结构具有某些特定的性质：它们存在于所有生物体内，高度的等位基因变异性，共显性遗传以及易于实现自动化分析，这些性质都使它们成为基因组作图以及特定基因位点克隆较好的工具［２９］。ＩＳＳＲ标记是适于种间或种内变异调查的一种分子标记方法，其结果可用来建立中药的指纹图谱。

３．４ＤＮＡ分子诊断技术

ＤＮＡ分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，而且作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一细胞均含有相同的遗传信息［６］。因此，以

ＨＰＣＥ是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳程度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术，对于成分复杂的中药尤其适用，宜应用于大量药材品质评价。

综合了ＨＰＣＥ的高效和ＨＰＬＣ的选择优势而发展），克服了ＨＰＣＥ选择性起来的毛细管电泳色谱（ＣＥＣ

差和分离中性物质困难的缺点，同时大大提高了液相色谱的分离效率，开辟了高微分离技术的新途径［２５］。

ＤＮＡ分子特征作为遗传标记的ＤＮＡ分子诊断技术比在形态、组织和化学水平上检测更能代表中药分析的遗传本质。

动物药材特别是以部分组织器官入药和切成块的药材，由于外部形态特征已被破坏，组织学特征不明显，理化成分复杂，较难准确测定。而由于ＤＮＡ分子标记直接分析的是生物基因型和非表现型，其鉴别结果不受其他因素影响，因此ＤＮＡ分子指纹图谱可为中药品种鉴别提供更加准确可靠的手段。

ＨＰＣＥ／ＭＳ联用将ＨＰＣＥ的高分离效率和ＭＳ的

定性优势结合起来，建立药材和复方药材的定性和多种成分的多指标定量而形成的指纹图谱，进一步拓展了ＨＰＣＥ在中药质量分析中的应用范围。

３．５分子生物色谱

现代分子生物学的发展，逐步阐明了体内神经介质、酶、受体在生命活动中所起的调节作用。分子生物色谱是把生物体内活性物质如酶、受体、传输蛋白等固定于色谱填料中，利用中药中活性成分与他们的相互作用，将色谱分离与分子生物医学二者的新成果紧密结合起来，建立有效成分指纹分析质量控制方法，并为组合中药的研究提供有效分子的结构信息［３０］。对于有效成分尚未清楚的中药，由于分子生物色谱以生物活性分子间广谱的相互作用为基础，也可利用其指纹分析法进行快速的质量监控。

此外，Ｘ射线衍射也可以从整体上反映一般成分和主要成分的分布概况，从而可以提供较全面的有鉴定意义的数据［３１］。该法既能反映中药材整体固有结构特征，又能表现来自局部成分变化的图谱化与数值化。它可以揭示中药材道地性客观规律，可以用于性

３分子诊断技术

３．１随机扩增片断多态性标记技术（ＲＡＰＤ）

这项ＤＮＡ多态检测技术具有操作简便、灵敏快速、费用低廉、安全等优点，

已广泛应用于中药的鉴

定、分类以及药材的道地性等方面的研究［２６］。如采用基因组总ＤＮＡＲＡＰＤ标记法可较廉价、快速地提供待测物的遗传信息［２７］。一般来说，采用此法对性状相似的中药进行研究较为合理。事实上，ＲＡＰＤ标记法已被应用于植物居群或品种间遗传距离的分析［２８］。）３．２聚合酶链反应技术（ＰＣＲ

核酸序列包含着生物体所必需的遗传信息。大部分性状可以随这些分子而进行相对稳定的遗传。其中一部分维持遗传性状，另一部分则具有个体间的差异性。由于这其中８５％以上的序列都是重复序列，因而

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计算机信息处理技术及仪器分析技术的迅速发展和各种技术的科学性、准确性和灵敏度的提高，使现代分析技术在中药指纹图谱研究中的应用更加广泛，这必将对中药现代化的进程起到巨大的推动作用。

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