实验一 蛋白质的颜色反应和沉淀反应
一、实验目的
（1）掌握鉴定蛋白质的原理和方法
（2）熟悉蛋白质的沉淀反应；进一步掌握蛋白质的有关性质
二、实验原理
（1）蛋白质颜色反应原理：蛋白质分子中的某些或某种基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，是一些常用蛋白质定量测定的依据；但颜色反应不是蛋白质的专一反应；
1、米伦反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。
2、双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3、黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。
4、 茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。
亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。
（2）蛋白质沉淀反应原理：多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
1、蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。
2、有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀
3、重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。
4、生物碱试剂沉淀蛋白质原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。
三、实验器材
1、吸管1.0（×3）、0.50ml(×1)、2.0ml(×2)、5.0ml(×2)
2、试管1.5㎝×15㎝(×7)
3、滴管
4、电炉
四、实验试剂
（1）卵清蛋白液 0.5%苯酚溶液 米伦试剂 0.1%茚三酮溶液 尿素 10%氢氧化钠溶液 比重1.42的浓硝酸 1%硫酸铜溶液
（2）硫酸铵晶体 95%乙醇 结晶氯化钠 1%醋酸铅 5%鞣酸溶液 饱和苦味酸溶液 1%醋酸溶液
五、实验步骤及实验结果
（1）米伦氏反应：a、用苯酚做试验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦试剂约0.5ml,小心加热，溶液即出现玫瑰
红色如图
b、用蛋白质溶液做实验：取2ml蛋白质溶液，加0,5ml米伦试剂，小心加热，凝固的蛋白质出现红色，如图
（2）双缩脲反应
a、取少量结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却，然后加10%氢氧化钠溶液1ml摇匀，再加两滴1%硫酸铜溶
液，混匀，有紫色出现如图
b、另取一试管，加蛋白质溶液1ml,再加10%氢氧化钠溶液1ml及1%
硫酸铜溶液两滴，混匀，出现紫玫瑰色如图
（3）黄色反应
于一干燥试管中，置蛋白质溶液1ml及浓硝酸5滴，加热冷
却后，溶液颜色如图再加10%氢氧化钠5滴，溶液颜色如图
（4）茚三酮反应
取1ml蛋白质溶液置于试管中，加8滴茚三酮溶液，加热至
沸，即有蓝紫色出现，如图
（5）蛋白质盐析作用
a、取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出，如图
b、将上述混合液过滤，溶液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白，再加水稀释，沉淀溶解
（6）乙醇沉淀蛋白质
取蛋白质溶液1ml,加晶体氯化钠少许，待溶解后再加入95%乙醇2ml
混匀，观察到有沉淀析出
（7）重金属盐沉淀蛋白质
取试管2支各加蛋白质溶液2ml,一管内滴加1%醋酸铅溶液
另一管内滴加1%
硫酸铜溶液，至有沉淀生成
（8）生物碱试剂沉淀蛋白质
取试管两支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸铅溶液5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，观察到结果如
图
，另一管中加饱和苦味酸溶液数滴，观察结
果如图
六、实验结果分析
在本次实验中蛋白质盐析现象不明显,究其原因是饱和的硫酸铵溶液一加到蛋白质溶液中去后,它的浓度就变小,导致盐析能力减弱。我觉得要使这个实验取得较好的效果,应在蛋白质溶液中加硫酸铵晶体,边加边振荡直至不再溶解,这时会有大量的蛋白质析出。所以,做蛋白质盐析实验首先应注意浓度。
另外的一些思考：
1、我认为做蛋白质的盐析实验时，可以先把蛋白质溶液的PH调到等电点，再加入饱和中性盐，这样会更利于沉淀的析出
2、通过这次蛋白质的沉淀实验，我明白了为什么鸡蛋清可以用作铅或汞中毒的解毒剂，也明白了为什么氯化汞可以作为杀菌剂，都是因为：重金属盐类易于蛋白质结合成稳定的沉淀而析出，该沉淀不溶于水，且这个沉淀过程不可逆。