实验一、牧草田间性状鉴定和亲本选配
一：目的和意义
学习牧草和草坪草田间农艺性状和生产性能测定的方法。能够设计育种计划，选择适宜的亲本，进行亲本选配。要求学生提前复习已做过的实验内容，了解本实验的操作程序及注意事项。
二：材料和用具
1. 材料
不同种属、不同生活年限的豆科、禾本科或其他科人工草地饲料作物地。
2. 用具
电子天平、斤秤、镰刀、菜刀、线绳、塑料袋、剪刀、钢卷尺。
三：方法
豆科、禾本科、其他科牧草的田间农艺性状测定
（一）产草量的测定：刈割法
在牧草地取样4处，每处0.25~1m2，用镰刀或剪刀齐地面（生物原产量）或距地面3~4cm（经济产量割下）或剪下牧草并立即称重得鲜草产量，从鲜草中称取1000g 装入布袋阴干，至重量不变时称重即为风干重。再从风干或鲜草中称取500g ，放入105℃烘箱内经10min 后降温到65℃，经24h ，烘至恒重，即为干物质重（绝干重）。因为测定的目的不同，时间规定也不一样，按时间特征来归纳，可以有3种产量的测定：
（1）平均产量是在人工草地利用的成熟时期测定第一次产量，当牧草生长到可以再次利用的高度时，再测定其再生草产量。再生草可以测1次、2次乃至多次。各次测定的产量相加，就是全年的产量，再除以次数，即为平均产量。
（2）实际产量也叫利用前产量，即比测定平均产量早一些或晚一些所测定的产量叫实际产量。第一次测定后每次刈割或放牧时重复测定产量，各次测定的产量之和，就是全年实际产量。
（3）动态产量是在不同时期测定的一组产量。在进行这项工作时，要在一定的地段，设立有围栏保护的定位样地，在样地上根据设计并预先布置样方，进行定期的产量测定。动态产量的测定可按牧草的生育期，也可按一定的时间间隔，如10d 、15d 、1个月或1个季度测定1次。
生育期是指刈割时的生长发育阶段。
（二）种子产量测定
（1）选定样方6~10个，总面积为6~10m2
（2）调查每样点有效株数，平均之，再求每亩株数。公式为：
每亩株数=取样点平均株数（株/m2）
（3）调查每株平均粒数（代表性植株20株平均）。
（4）通过千粒重的测定，求出每千克粒数。公式为：
每千克粒数=1000（g ）/千粒重（g ）×1000
（5）根据下列公式求出每公顷草地种子产量：
种子产量（㎏/h㎡）=每公顷株数×每株平均粒数/每千克粒数
或者将样方内植株全部刈割后脱粒、称重再折算成公顷产量
（四）植株高度和生长速度的测定
1. 植株高度
牧草的株高与产草量成正比。牧草的株高与牧草的利用方式（刈割、放牧或兼用）、草层高度与各草种在混播草地中的比例有密切关系。植株高度分为：
（1）草层高度：大部分植株所在的高度。
（2）绝对高度：植株和地面垂直时的高度。即把植株拉直后植株的长度。
（3）自然高度：即牧草在自然生长状态下的高度，测定时从植株生长的最高部位到垂直地面的高度。
植株高度从地面量至（开花前）或花序顶部，禾本科牧草的芒和豆科牧草的卷须不算在内。株高的测定采用定株或随机取样法，取代表性的植株40株平均。测定时间可根据不同的测定目的在各物候期进行或每10d 测定1次。
2. 牧草生长速度
指单位时间内牧草增长的高度。其测定多结合株高测定进行，采用定株法，每10d 测定1次，然后计算出每天增长的高度。随机取样时如2次测定时间过短，也可能出现负增长。
（五）分蘖（分枝）数的测定
牧草从分蘖节或根颈上长出侧枝的现象称为分蘖（分枝）。分蘖（分枝）数的多少不仅与播种密度、混播比例有关，且直接关系到产量的高低。分蘖（分枝）数的测定，根据不同目的可在不同物候期进行，一种方法是在测定过产草量的样方内区代表性植株10株，连根拔出（拔5~10cm深即可），数每株分蘖（分枝）数，进行平均；二是取代表性样段3行，每行内定50~100cm长，然后数每行样段内每一单株的分蘖（分枝）数，平均之。
（六）亲本选择
用作母本的植株应具有该品种典型性状，生长健壮，无病虫害。
实验二、CTAB 提取DNA
一、 实验原理
TAB 法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵), 是一种阳离子去污剂, 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性. 在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物, 只是不能沉淀核酸. 通过有机溶剂抽提, 去除蛋白, 多糖, 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.
二、 实验器材
1、121.1g Tris溶于800ml 无菌水中，加浓HCL 调pH 到8.0，定容至1L ，
高压灭菌。
2、186.1g EDTA-Na·2H2O 溶于800ml 无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈
搅动，用NaOH 调pH 值到8.0（约20g ），定容至1L ，高压灭菌。
3、204.75g NaCL溶于1L 无菌水中，高压灭菌。
4、10% CTAB溶液
10gCTAB 溶于80ml 无菌水中，定容至100mL ，高压灭菌。
5、氯仿-异戊醇（24:1体积比）
7、RNAaseA
8、异丙醇
9、无水乙醇
10、3mol/L醋酸钠
11、1×TE 缓冲液
实验仪器：
液氮罐、1.5ml 离心管、1.5ml 离心管架、恒温水浴摇床、枪及枪头（1ml 和200ul ）、离心机（转速可调至4000rpm 和10000rpm ）、剪刀
三、 实验步骤
1、65℃预热CTAB45分钟，在1.5毫升离心管中加入600微升CTAB 和20微升乙醇，放入45℃水中40-60分钟，期间每隔几分钟晃动离心管，以便叶片与CTAB 充分反应。
2、在离心管中加入630微升氯仿异戊醇，晃动10分钟，摇匀，否则DNA 量明显减少，可以在振荡器上混匀。
3、在25℃、10000转每分钟离心10分钟。
4、用剪过的枪头抽取上清液450微升到另一只灭菌后的离心管中，加入提前冷却的异丙醇150微升，轻摇几下，看见白色絮状物最好，刚入-20℃冰箱中冷冻1小时。
5、取出离心管，在4℃、10000转每分钟条件下离心10分钟。
6、倒掉液体后加入500微升TE 溶解，20分钟后加入500微升氯仿异戊醇，轻摇10分钟。
7、4℃、10000转每分钟条件下离心10分钟。
8、取上清液400微升到新的离心管中，加入1000微升污水乙醇和40微升醋酸钠，轻摇几下，可见白色絮状物，放入-20℃条件下冷冻几小时或过夜。 9、0℃，12000转每分钟条件下离心10分钟。
10、倒掉液体，加入70%乙醇800微升，0℃，12000转每分钟条件下离心5
钟。
11、倒掉液体，风干后加入100微升TE ，先在4℃冰箱中放置一天左右，直到DNA 全部溶解，然后转到-20s ℃冰箱中待用。
实验三、豆科牧草的扦插技术
一、实验目的
豆科牧草的无性繁殖技术是育种工作的重要技术手段之一，通过本试验具体操作，切实掌握扦插技术及苗床管理要领，为今后在育种工作中的熟练的应用打下基础。
二、实验方法与步骤
1、切取苜蓿枝条：用刀片水平切取生长较高的枝条的上半截（连同顶叶）。枝条长度约15-18cm 。
2、扦插枝条：切取的枝条于当日扦插。扦插前，剔除顶叶外的其余叶片。在事先准备好的实验小区里的实验圆筒中，扦插枝条，使之与土壤紧密接触，扦插后，附上培土，以便于定株观察和田间管理。
3、田间管理：扦插结束后，随即浇水湿润。生育前期浇水量多且勤，后期浇水量小且次数少。
实验四育种实验方案
一、育种目标
学习牧草和草坪草田间农艺性状和生产性能测定的方法。能够设计育种计划，选择适宜的亲本，进行亲本选配。
二、育种方法和步骤
1传统育种方法
1.1根据基因突变的原理育种
常用的方法有: X 光或者紫外线照射及综合处理; 将植物体通过基因突变产生变异芽体，将变异芽体发育成的枝条进行嫁接或扦插，也可以将变异芽的细胞进行组织培养，以上均能获得新品种。
1.2根据基因重组的原理育种
常用的方法为杂交育种，是遗传性不同的个体之间进行杂交获得杂种，继而在杂种后代中进行选择以育成符合生产要求的新品种的方法，根据进行杂交的亲本亲缘关系远近，杂交又分为品种间杂交和远缘杂交两大类。杂交育种的手段有系谱法、混合法等，通过杂交获得杂交育种在作物和牧草育种中占据很重要的位置，据1999年统计，我国已通过审定登记的牧草品种攻击207个，其中杂交育成84个，占育成品种总数的40.6%。2000-2001年参加国家品种区域试验的冬小麦品种80个，春小麦品种36个，其中69个冬小麦品种和34个春小麦品种都是用杂交方法选育而成的，站育成品种的88.8%。在农作物上杂交育种在20世纪50年代占育成品种的14.8%;60年代和70年代分别占35.5%和35.4%;80年代大79%。由此可见杂交育种方法在作物育种中的重要意义。
1.3根据染色体变异的原理来进行育种
1.3.1单倍体育种
首先通过花药离体培养得到单倍体，然后将单倍体的幼苗用秋水仙素处理使染色体数目加倍，这样就得到纯合的品种。这种育种方法的优点:明显缩短了育种的年限。
1.3.2多倍体育种
可以分为自然条件下多倍体育种和人为条件下多倍体育种。自然条件下的多倍体:如帕米尔高原地区气候条件比较恶劣，如温差骤变等，导致一个已经完成染色体复制的细胞中的纺锤体形成受阻。人为条件下的多倍体:可以使用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，抑制纺锤体的形成，最终得到染色体加倍的个体。
1.3.3利用体细胞杂交进行育种
利用白菜和甘蓝的体细胞进行融合得到白菜, 甘蓝杂种细胞，将这样的杂种细胞通过组织培养得到新品种。这种育种方法的优点:继承了双亲的遗传特性，克服了远缘杂交不亲和的障碍。
1.4利用核质互作进行育种
主要利用了恢复系和雄性不育系。利用雄性不育系，可以省去人工去雄，降低制种成本，提高种子质量。它的重要意义更在于对一些不能大量去雄的植物，如水稻、高粱等，开拓了利用杂种优势的新途径。通常所见到的雄性不育大致可分为两大类，一类是由环境条件不适、生理差异等所引起，往往不能遗传; 另一类是由细胞质及核内基因控制，是可遗传的类型。Sears(1943—1947) 在总结前人的工作的基础上，把各种植物的雄性不育性概括为三种类型:质不育型、核不育型和核质互作不育型。Edwardson(1956)将雄性不育分为核不育和质不育两大类，质不育实质上就是核质互作不育。
2细胞生物技术在苜蓿育种中的应用
2.1组织培养在苜蓿育种中的应用
细胞组织培养及其与诱变结合的技术是作物育种中创造种质资源变异、改良目标性状、培育新品种(系) 的一个重要途径。细胞组织培养是指在人工控制条件下, 将作物的任何一部分, 如器官、组织、细胞, 进行离体培养使其发育形成完整的植物体。其具体应用于:原生质体培养和体细胞杂交, 脱毒和快繁培养, 花粉培养(单倍体育种), 转基因受体培养, 胚挽救培养(防止远缘杂种幼胚早夭), 诱变体培养等。在组织培养过程中作物的细胞处于不断分裂的状态, 极易受培养条件和外界条件的影响而发生变异, 使突变频率大幅度提高, 这为选择有利的变异性状创造了条件。若在此时加入物理和化学等诱变因子, 便可培养出含目的性状的变异体。比如:在某作物的细胞培养基中加入一定数量的NaCl, 就可以诱导和筛选出数量可观的抗盐、抗旱变异体。
2.2单倍体培养与单倍体诱导技术
单倍体培养与单倍体诱导是根据不同作物的自身特点通过培育单倍体的途径快速获得纯合二倍体的一种高效育种方法。主要包括:花粉培养、子房培养和无融合生殖等技术。花粉培养更适合于水稻和小麦等作物, 它们的成苗率较高, 操作相对简单, 容易取得成功。而玉米和高粱的花粉培养难度就比较大, 尤其是玉米,90%以上的基因型不能分化出幼苗。采用药
选育纯合二倍体自交系, 可以获得与水稻和小麦花粉培养选育剂诱导玉米无融合生殖技术。纯系的同样效果。
3转基因及DNA 分子标记技术在牧草育种中的应用
3.1转基因技术在牧草育种上的应用
转目的基因育种技术是把已分离出来并构建好的一种或多种目的基因转入拟改良受体, 培育出具有目的性状的新种质或新品种的技术。它可以按人们的需求导入某种特定的基因, 具有目的性强, 快速而准确的优点。应用这种技术可以打破远缘物种间的生殖隔离, 使各种物种间的基因能够进行交流。
3.2 DNA 导入与分子标记在牧草育种中的应用
外源总DNA 导入和选育技术是我国科学家独创的一种分子育种技术。它是在不具备分离目的基因的条件下, 通过向拟改良的受体转移含目的性状的供体总DNA, 筛选具有目的性状的后代, 培育新种质和新品系的方法。它可以破除远缘物种间的生殖隔离而进行基因交流。它是一种适用面广、转化效率高、简便、经济、实用且易于操作的重要遗传转化方法。
分子标记辅助育种技术是利用与目的性状基因紧密连锁的的分子标记, 鉴定和筛选具有目的性状的种质资源和育种后代, 或分析和评价种质资源、亲本之间的亲缘关系的一种方法。与传统育种依表现型进行选择相比, 本项技术具有选择效率高, 结果准确等特点, 特别是对隐性基因控制的性状选择更为有效。同时, 分子标记也能为分离和提取与之连锁的目的基因创造技术条件。
以在我国首藉育种方面加以采用。
实验五牧草开花习性、花器构造观察与记载
一、实验目的和要求
通过对牧草花器结构及开花授粉习性的观察，了解不同牧草的花器官结构特征与开花授粉特点，以及两者之间的关系；熟悉牧草开花习性调查的主要观察项目和观察方法。
二、实验材料和用具
材料：紫花苜蓿、白三叶
用具：体视显微镜、解剖针、镊子、剪刀、笔、记录纸等。
三、实验原理
不同的牧草因其自身的发育特点不同，往往具有不同的花器官结构特征和开花授粉习性。如有的牧草为风媒花，而有的牧草则靠蜜蜂、蝴蝶等传粉媒介进行授粉；有的牧草花器官结构便于自花授粉，而有的则便于异花授粉。此项观察可作为识别品种、制定杂交计划的主要依据，也可为采留种子，选育自交系等提供理论指导。
四、实验内容及方法
以紫花苜蓿、白三叶为材料，详细观察其花器官的组成与结构特征，了解其开花授粉特点。
1 、花器结构的观察
一般两性花植物的花朵由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官组成，多数植物的花朵基部还着生有花苞片，而单性花则缺少其中的雄蕊或雌蕊。通过观察比较，明确不同牧草的花部构造及其形态特征，了解授粉习性与其之间的关系。
2 ．开花授粉习性的观察
1 ）花芽类型：植物花芽的类型基本上可以分为纯花芽和混合花芽两种类型。纯花其芽内只有花器官，芽 萌发后，只开花结果，不抽生枝条； 混合花芽在芽内除有花器官外，还存在枝叶或叶的原始体，开花的同时可抽生枝条。
2 ）开花时间及花期长短：不同的牧草其开花时间差异较大。此外，不同品种的始花期、盛花期、终花期及整个开花过程的长短也不相同。通过观察明确不同牧草花期和开花规律对于人工杂交具有重要的指导意义。
3 ）花型：包括单瓣、重瓣，大花、小花等。花型的表现对于植物的传粉和结实会产生影响。
4 ）花性：包括雌雄异株、雌雄同株异花和雌雄同花（两性花）。有些植物在一个植株上既有两性花又有单性花；还有些植物尽管具有两性花，但表现为雄蕊或雌蕊退化。
5 ）花瓣：花瓣的颜色、形态等表现往往与植物的传粉方式和授粉习性有较大的关系。如开花时花瓣紧闭者一般采用自花授粉。
6 ）雄蕊和雌蕊：雄性和雌蕊的生长发育状态、着生方式与植物的授粉特点、结实能力等有很大的关系。
7 ）花粉：花粉是植物自然授粉和人工杂交的主要物质基础。同样的两性花品种，花药中产生花粉的多少是不同的，有些很多，有些中等，有些则很少。
六、 作业
总结出所观察植物其花器结构及其开花授粉习性。