生物化学实验报告
姓 名： 王晨阳
学 号： 3130101027
专业年级： 2013级临床医学（卓越创新班）
组 别： 第一实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：【实验目的】：
1.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理以及实验操作技术。
2.掌握制作标准曲线的方法和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。 【实验原理】： 1.双缩脲反应
在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC-NH-CONH2)能与Cu
2
XX】
作用，形成紫色或紫红色的络合
物。在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜溶剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu
2
复合物。
2.Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。蛋白质-Cu
2
复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸
和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
3.在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性相关，通过与同样处理的蛋白
质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。 【实验材料】：
样品：健康人血清（稀释300倍）
试剂：1.牛血清白蛋白标准液（200gml) 2.碱性硫酸铜法溶液 3.Folin-酚试剂 4.蒸馏水
仪器与器材：V-1100分光光度计、恒温水浴锅、试管6支、试管架、加样枪、加样枪架 【实验步骤】：
实验流程：反应体系系设置双缩脲反应Folin-酚反应比色测定 操作步骤： 1.反应体系设置
2.双缩脲反应：向6支试管分别加入碱性硫酸铜溶液2ml，混合均匀，室温放置10min 3.Folin-酚反应：加入Folin-酚试剂0.2ml，迅速混匀，40度水浴10min，冷却至室温 4.比色测定：以500nm波长比色，以1号管作空白对照，测出各管吸光度值A
注意事项：1.Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液之后，必须立即混匀，是还原反
应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂破坏前；
2.因反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间；
3.按操作表顺序添加试剂，移取试剂时一定要精确，以避免标准曲线误差过大。
4.要多次测量取平均值
【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：
【实验条件】： 实验时间：下午； 实验温度：室温； 操作技巧：
1.加入folin-酚试剂后要迅速充分混合；
2.要待水浴后的混合溶液充分冷却后再使用比色仪； 3.保证使用前实验试剂未被污染；
4.严格控制各种试剂的用量、浓度，使用要求的规格
【实验现象】：在稀释的牛血清白蛋白标准液与双缩脲试剂的混合溶液中加入Folin-酚试剂后，摇匀混合溶液从无色透明变为蓝色 【实验数据】： 500nm波长吸光度值记录
测定次数
2
3
4
5
6
XX】
1 2 3 各管平均A值 蛋白质浓度（ug/ml）
0.249 0.249 0.247 0.248 40
0.264 0.263 0.264 0.264 80
0.349 0.349 0.349 0.349 120
0.396 0.396 0.396 0.396 160
0.211 0.212 0.211 0.211 未知
【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：【实验结果】：
XX】
将样品6的数据带入上式，可算得X=62.82
故样品管中血清蛋白浓度=62.82*300*2/1000=37.69g/l 【交流讨论】：
1. 本次实验测得数据偏小，与某些操作不当有关。如测吸光度前装样品时忘记润湿小玻璃杯，而玻璃杯上残留有水滴，使测得的浓度是稀释后的浓度
2. 实验过程中可能取蒸馏水时，取样枪使用不当，蒸馏水取得偏多，或者取待测样品较少
【实验结论】：所得实验结论与预期不太相符，小于预期值 思考题：
1.试述Folin-酚试剂法的优点？
答： （1）灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 （2）操作简单，不需特殊仪器设备。
2、应用这种方法应如何注意？
答：此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2、-CH2-NH2、-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵以及巯基化合物均可干扰反应。此外，所测的蛋白质样品中，如含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素、硫酸钠、硝酸钠、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需要做校准曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠-氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需要提高碳酸钠-氢氧化钠浓度1~2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病
3.Lowry’s法测蛋白质含量的干扰因素有哪些？
干扰因素：对双缩脲反应有干扰的离子，同样干扰Lowry’s反应，而且对后者影响大得多，酚类、柠檬酸、硫酸铵、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。甘氨酸对其有负干扰，甘露醇对其有正干扰。